Einfluss medikamentöser Inhibition des Phosphoinositid-3-Kinase Signalwegs auf die Regulation mitochondrialer Apoptose in peripheren T-Zell Lymphomen

Impact of pharmacological inhibition of the phosphoinositide 3-kinase pathway on the regulation of mitochondrial apoptosis in peripheral T-cell lymphomas

by Gerrit Nothnick
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-10-01
Date of issue:2024-09-13
Advisor:Prof. Dr. Gerald Wulf
Referee:Prof. Dr. Holger Bastians
Referee:Prof. Dr. Ralf Dressel
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10739

 

 

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Abstract

English

Peripheral T-cell lymphomas are a group of genetically heterogeneous and aggressive diseases. Poor tumor response to CHOP-based chemotherapy protocols and a lack of treatment options in relapses lead to a generally poor prognosis. The PI3K-AKT-mTOR signaling pathway affects cell proliferation, metabolism, and apoptosis. Genetic alterations in this pathway have been described in a variety of malignancies, including peripheral T-cell lymphomas. In a clinical Phase 1 study involving patients with refractory and relapsed peripheral T-cell lymphomas, the PI3K-δ/γ inhibitor Duvelisib showed promising response rates. The aim of this work was to develop a rational combination strategy to maximize the effects of PI3K inhibitors. To this end, the investigation and reactivation of components of mitochondrial apoptosis were the focus. Initially, the effects of the PI3K inhibitors Copanlisib and Duvelisib on the proliferation of peripheral T-cell lymphoma cell lines were examined. To determine how PI3K inhibition alters components of mitochondrial apoptosis, dynamic BH-3 profiling was performed. Additionally, Luminex assays and Western blot analyses were used to assess the expression of mitochondrial apoptosis components under PI3K inhibition. Finally, in vitro combination testing was conducted, and synergy calculations were made for various drug combinations. The PI3K inhibitors led to significant proliferation inhibition only in a few cell lines. However, dynamic BH-3 profiling demonstrated that PI3K inhibition increases apoptotic priming and enhances the relevance of anti-apoptotic Bcl-2 family members. Notably, the anti-apoptotic protein Mcl-1 played a crucial role in blocking mitochondrial apoptosis, and increased Mcl-1 dependence was observed after PI3K inhibition in nine of ten cell lines studied. The Luminex assay and Western blot analyses showed that there was no degradation of Mcl-1 under PI3K inhibition. Based on these results, the hypothesis was formulated that a combination of PI3K inhibitors and BH-3 mimetics would show synergistic effects in peripheral T-cell lymphoma cell lines. To test this, a selection of cell lines was incubated with Copanlisib or Duvelisib and ABT-263, a dual Bcl-xL/Bcl-2 inhibitor, or AZD-5991, a selective Mcl-1 inhibitor. The evaluation of combination tests revealed that the combination of PI3K inhibitors and the Mcl-1 inhibitor AZD-5991 produced synergistic effects in eight of nine tested cell lines. In summary, this work demonstrates that treatment with PI3K inhibitors and an Mcl-1 inhibitor represents a rational combination strategy for peripheral T-cell lymphomas. Further investigations in in vivo models and ultimately clinical trials are needed to determine which drugs should be used for optimal combinations and to assess how patients might benefit from such therapies.
Keywords: T cell lymphoma; PI3K pathway; PI3K Inhibition; Duvelisib; Copanlisib; Apoptosis; BH3 profiling; Peripheral T cell lymphoma; Mcl-1; AZD-5991; Mitochondrial apoptosis; AKT; myrAKT; ABT-263; Synergy calculations; phosphoinositide 3-kinase

German

Periphere T-Zell Lymphome umfassen eine Gruppe genetisch heterogener Erkrankungen, die klinisch aggressive Verläufe zeigen. Ein schlechtes Ansprechen der Tumore auf CHOP-basierte Chemotherapieprotokolle und mangelnde Therapieoptionen im Rezidiv führen zu insgesamt schlechten Prognosen. Es besteht daher ein dringender Bedarf für neue Therapieoptionen zur Behandlung peripherer T-Zell Lymphome. Der PI3K-AKT-mTOR Signalweg beeinflusst die Proliferation, den Metabolismus und die Apoptose einer Zelle. Genetische Alterationen des Signalwegs sind in einer Vielzahl von malignen Erkrankungen – darunter auch in peripheren T-Zell Lymphomen – beschrieben worden. In einer klinischen Phase-1-Studie in Patienten mit refraktären & rezidivierten peripheren T-Zell Lymphomen zeigte der PI3K-δ/γ Inhibitor Duvelisib vielversprechende Ansprechraten. Ziel dieser Arbeit war es, eine rationale Kombinationsstrategie zu entwickeln, um die Effekte von PI3K-Inhibitoren maximieren zu können. Hierzu stand die Untersuchung und Reaktivierung Komponenten mitochondrialer Apoptose im Fokus. Zunächst wurde hierzu der Einfluss der PI3K-Inhibitoren Copanlisib und Duvelisib auf die Proliferation von Zelllinien peripherer T-Zell Lymphome untersucht. Um herauszufinden, inwiefern PI3K-Inhibition die Komponenten mitochondrialer Apoptose alteriert, wurde dynamisches BH-3 Profiling durchgeführt. Mittels eines Luminex-Assays und Western Blot Analysen wurde daraufhin ergänzend die Expression von Komponenten mitochondrialer Apoptose unter PI3K-Inhibition ermittelt. Zum Abschluss der Arbeit wurden in vitro Kombinationstestungen durchgeführt und Synergie Kalkulationen für verschiedene Medikamentenkombinationen angestellt. Die PI3K-Inhibitoren führten in relevanten Konzentrationen nur in ausgewählten Zelllinien zu einer starken Proliferationshemmung. Mit dynamischem BH-3 Profiling konnte jedoch gezeigt werden, dass es durch PI3K-Inhibition zu einer Erhöhung des apoptotischen Primings kommt und die Relevanz antiapoptotischer Bcl-2 Familienmitglieder gesteigert wird. Besonders das antiapoptotische Protein Mcl-1 nahm eine entscheidende Rolle bei der Blockierung mitochondrialer Apoptose ein und eine erhöhte Mcl-1 Abhängigkeit konnte nach PI3K-Inhibition in neun von zehn untersuchten Zelllinien festgestellt werden. Der Luminex-Assay und die Western Blot Analysen zeigten, dass es zu keiner Degradation von Mcl-1 unter PI3K-Inhibition kommt. Basierend auf den Ergebnissen wurde die Hypothese formuliert, dass eine Kombination von PI3K-Inhibitoren und BH-3 Mimetika in Zelllinien peripherer T-Zell Lymphome synergistische Effekte zeigt. Um dies zu überprüfen, wurde eine Auswahl von Zelllinien jeweils mit Copanlisib oder Duvelisib und ABT-263, einem dualen Bcl-xL/Bcl-2 Inhibitor, oder AZD-5991, einem selektiven Mcl-1 Inhibitor, inkubiert. Die Auswertung der Kombinationstests ergab, dass die Kombination aus PI3K-Inhibitoren und dem Mcl-1 Inhibitor AZD-5991 in acht von neun getesteten Zelllinien synergistische Effekte hervorgerufen hat. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Behandlung mit PI3K-Inhibitoren und einem Mcl-1 Inhibitor eine rationale Kombinationsstrategie für periphere T-Zell Lymphome darstellt. Um herauszufinden, welche Medikamente für eine optimale Kombination eingesetzt werden sollten und inwiefern Patienten von solch einer Therapie profitieren könnten, bedarf es weiterer Untersuchungen an in vivo Modellen und letztlich klinischer Studien.
Schlagwörter: Periphere T-Zell Lymphome; PI3K Inhibition; Mitochondriale Apoptose; Apoptose; PI3K Signalweg; Phosphoinositid-3-Kinase; Synergie Kalkulationen