Characterization of Novel Proteins Modulating the Nanoscale Organization of the Membrane-Associated Periodic Skeleton in Neurons

by Victor Macarrón Palacios
Doctoral thesis
Date of Examination:2023-09-29
Date of issue:2024-09-19
Advisor:Prof. Dr. Stefan Hell
Referee:Prof. Dr. Stefan Hell
Referee:Prof. Dr. Fred Wouters
Referee:PD Dr. Hauke Werner
Referee:Dr. Katrin Willig
Referee:Dr. Christian Vogl
Referee:Prof. Dr. Henning Urlaub
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10695

 

 

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Abstract

English

The Membrane-associated Periodic Skeleton (MPS) is a lattice located underneath the neuronal plasma membrane, characterized by a distinctive ~190 nm periodic architecture imposed by the nanoscale arrangement of its main components actin, spectrin, and adducin. To date, over 400 proteins have been found to interact with the MPS. However, despite the enormous progresses that have been made in the last decade, the underlying mechanisms of MPS regulation are only starting to emerge. Inspired by preliminary biochemical data inferring an interaction between a neuronal spectrin isoform and Palm1, this thesis identifies two proteins of the Paralemmin family, Palm1 and Palm2, as novel components of the MPS, elucidating their key roles over the course of neuronal development. Palm1 it is anchored to the inner side of the plasma membrane with a reported role in membrane expansion, filopodia formation, and spine maturation. By leveraging cutting-edge nanoscopy techniques (STED and MINFLUX), this study proposes a dual role for Palm1 in neurons. The first role is related to neuritogenesis, cellular growth and neurite expansion. Indeed, Palm1 overexpression increased neuronal arborization, whereas depletion of Palm1 delayed neuritogenesis, primarily suggesting a function in the regulation of actin dynamics. These processes are mainly mediated by a Palm1 isoform lacking exon 8 (Palm1ΔEx8), whose mRNA levels decay during neuron maturation. The second role is related to the regulation of the MPS architecture, which is mainly mediated by the full length Palm1 isoform. Palm1 is recruited into the already formed MPS to populate the actin rings and flank adducin, likely interacting with the N-terminus of ßII spectrin. Examination of overexpression, knock-out, and rescue experiments revealed that Palm1 levels alone regulate the periodic architecture of the MPS without altering the local concentrations of its components, showing that the nanoscale organization of the MPS is dictated by the amount of Palm1. Herein, this thesis describes for the first time a novel mechanism to modulate the MPS. Lastly, Palm1 knock-out neurons exhibited altered electrophysiological properties, with lower excitatory post synaptic currents and lower rheobase, probably as a result of the disturbance of both roles of Palm1. Since the MPS is present in virtually all neuronal cells and neuron types and Palm1 is maintained through vertebrates, these mechanisms might be conserved across brain regions and organisms, which would have significant implications for the understanding of the MPS regulation in the human brain. Palm1 is ubiquitously expressed in hippocampal neurons but its levels are reduced in the axon initial segment (AIS). This evidence raised the possibility that another member of the Paralemmin family might be present in neurons. Indeed, we identified Palm2 as a novel component of the AIS. Palm2 is present along the premature axon and is restricted into the AIS from DIV 5. However, it is not essential for axon specification and AIS assembly. Although Palm2 does not show a periodic organization at endogenous levels, it becomes periodic upon overexpression in all neuronal compartments, assuming a localization at the MPS comparable to Palm1. Interestingly, overexpression of Palm2 negatively impacted the AIS-specific MPS component ßIV spectrin both in terms of expression levels and periodic organization, suggesting a function in the modulation of the AIS structure. This hypothesis is supported by the evidence that neurons lacking Palm2 require higher currents to initiate an action potential. Altogether, this thesis provides an exhaustive characterization of both Palm1 and Palm2 in hippocampal neurons, identifying two novel proteins interacting with the MPS. Importantly, a novel approach to regulate this lattice is elucidated, opening up new opportunities for future studies on axon degeneration and neurological diseases, in which the MPS is involved.
Keywords: Paralemmins; membrane-associated periodic skeleton; spectrins; primary hippocampal neurons; cytoskeleton; axon; nanoscopy

German

Das membranassoziierte periodische Skelett (MPS) ist eine gitterartige Struktur, die sich unter der neuronalen Plasmamembran befindet. Es zeichnet sich durch seine charakteristische periodische Architektur von ~190 nm aus, die durch die nanoskalige Anordnung der Hauptbestandteile Aktin, Spektrin und Adducin entsteht. Bis heute wurden über 400 Proteine gefunden, die mit dem MPS interagieren. Trotz der enormen Fortschritte, die in den letzten zehn Jahren erzielt wurden, sind die zugrundeliegenden Mechanismen der MPS-Regulierung noch nicht vollständig bekannt. Aufgrund vorläufiger biochemischen Experimente, die auf eine Interaktion zwischen einer neuronalen Spektrin-Isoform und Palm1 hindeuteten, wurden in dieser Arbeit zwei Proteine der Paralemmin-Familie, Palm1 und Palm2, als neue Komponenten der MPS identifiziert und ihre Schlüsselrollen im Verlauf der neuronalen Entwicklung aufgeklärt. Es ist bereits bekannt, dass Palm1 an der Innenseite der Plasmamembran verankert ist und eine Rolle bei der Membranausdehnung, Filopodienbildung und der Dornreifung spielt. Durch den Einsatz modernster Nanoskopietechniken (STED und MINFLUX) wird in dieser Studie eine duale Rolle für Palm1 in Neuronen vorgestellt. Die erste Rolle steht im Zusammenhang mit der Neuritogenese, dem Zellwachstum und der Neuritenexpansion. Die Überexpression von Palm1 erhöhte die neuronale Arborization, während die Deletion von Palm1 die Neuritogenese verzögerte, was primär auf eine Regulierung der Aktindynamik hindeutet. Diese Prozesse werden hauptsächlich durch die Palm1-Isoform ohne Exon 8 (Palm1ΔEx8) gesteuert, dessen mRNA-Spiegel während der Neuronenreifung abfällt. Die zweite Rolle bezieht sich auf die Regulierung der MPS-Architektur, die hauptsächlich durch die Palm1-Isoform in voller Länge kontrolliert wird. Palm1 wird in das bereits gebildete MPS rekrutiert, um die Aktinringe zu besetzen und adducin zu flankieren, wobei Palm1 wahrscheinlich mit dem N-Terminus von ßII-Spektrin interagiert. Die Überexpressions-, Knock-out- und rescue Experimenten ergaben, dass allein die Palm1-Konzentration die periodische Architektur der MPS reguliert, ohne die lokalen Konzentrationen ihrer Komponenten zu verändern. Dies zeigt, dass die nanoskalige Organisation des MPS von den Palm1-Konzentrationen bestimmt wird. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal ein neuartiger Mechanismus zur MPS Modulation beschrieben. Abschließend, Palm1 knock-out Neuronen zeigten veränderte elektrophysiologische Eigenschaften, mit niedrigeren exzitatorischen postsynaptischen Strömen und niedrigerer Rheobase, wahrscheinlich durch die Beeinträchtigung der beiden Rollen von Palm1. Da das MPS in nahezu allen neuronalen Zellen und Neuronentypen vorkommt und Palm1 in allen Wirbeltieren erhalten ist, könnten die oben beschriebenen Mechanismen in allen Hirnregionen und Organismen konserviert sein, was erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis der MPS-Regulierung im menschlichen Gehirn haben könnte. Palm1 ist in hippocampale Neuronen ubiquitär exprimiert, seine Konzentration ist jedoch im axon initial segment (AIS) geringer. Dies deutet darauf hin, dass möglicherweise ein weiteres Mitglied der Paralemmin-Familie in Neuronen vorhanden sein könnte. Wir identifizierten Palm2 als eine neue Komponente des AIS. Palm2 befindet sich im vorläufigen Axons und ist ab DIV 5 im AIS lokalisiert. Palm2 ist jedoch für die Axonspezifikation und den Aufbau des AIS nicht notwendig. Obwohl Palm2 bei endogener Konzentration keine periodische Organisation aufweist, wird Palm2 nach seiner Überexpression in allen neuronalen Kompartimenten periodisch. Dabei wird vermutet, dass Palm2 eine ähnliche Lokalisation wie Palm1 am MPS hat. Interessanterweise wirkte sich die Überexpression von Palm2 negativ auf die AIS-spezifische MPS-Komponente ßIV-Spektrin aus, und zwar sowohl hinsichtlich der Expressionsmengen als auch der periodischen Organisation. Dies könnte sich aufgrund der möglichen Veränderungen der AIS-Struktur erklären lassen. Diese Hypothese wird durch den Nachweis verstärkt, dass Palm2-KO Neuronen, höhere elektrische Ströme benötigen, um ein Aktionspotenzial auszulösen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit eine umfassende Charakterisierung von Palm1 und Palm2 in hippocampale Neuronen und identifiziert zwei neue Proteine, die mit dem MPS interagieren. Insbesondere zeigt diese Thesis einen neuartigeren Ansatz zur Regulierung dieser gitterartigen Struktur, welche neue Möglichkeiten für künftige Studien zur Axondegeneration und neurologischen Erkrankungen bietet, bei denen das MPS involviert ist.
 
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