dc.contributor.advisor | Steinfeld, Robert Prof. Dr. | |
dc.contributor.author | Herholz, Leonie Linnea Elisabeth | |
dc.date.accessioned | 2024-09-23T09:24:08Z | |
dc.date.available | 2024-10-25T00:50:08Z | |
dc.date.issued | 2024-09-23 | |
dc.identifier.uri | http://resolver.sub.uni-goettingen.de/purl?ediss-11858/15501 | |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10759 | |
dc.format.extent | VIII, 91 | de |
dc.language.iso | deu | de |
dc.subject.ddc | 610 | de |
dc.title | Der Einfluss genetischer Mutationen im CIC-Gen auf den Folattransport | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | The influence of genetic mutations in the CIC gene on folate transport | de |
dc.contributor.referee | Steinfeld, Robert Prof. Dr. | |
dc.date.examination | 2024-09-26 | de |
dc.description.abstractger | Im Rahmen dieser experimentellen Arbeit wurde der Einfluss des Proteins Capicua auf die Expression von Proteinen, die am transzellulären Folattransport beteiligt sind, untersucht. Hierzu wurden zwei Missense-Mutationen und eine bereits beschriebene Stopmutation sowie der Wildtyp des Capicua-Gens in verschiedenen Zelllinien exprimiert und deren Effekt auf die Expression anderer Gene verglichen.
Untersucht wurden drei Mutationen im Capicua-Gen, die bei Patienten mit zerebraler Folatdefizienz detektiert wurden. Krankheitsdefinierend ist eine erniedrigte Konzentration von 5-MTHF im Liquor bei normwertigem peripherem Folatspiegel im Serum. Klinisch manifestiert sich die Erkrankung in der frühen Kindheit und führt unbehandelt zu fortschreitender psychomotorischer Retardierung, dyston-ataktischer Bewegungsstörung, sensorischen Ausfällen und zerebralen Krampfanfällen. MR-tomographisch konnten eine zerebelläre und teilweise zerebrale Hirnatrophie sowie fokale Myelinisierungsstörungen in der weißen Hirnsubstanz festgestellt werden. Bei rechtzeitigem Therapiebeginn zeigte sich ein gutes Ansprechen auf eine Folatsubstitution. In der genetischen Untersuchung der o.g. Patienten konnte in den bisher bekannten, für den Transport von Folat über die Blut-Liquor-Schranke relevanten Genen, keine Mutation nachgewiesen werden. In der Genom-Sequenzierung konnten jedoch Mutationen im Capicua-Gen detektiert werden. Außerdem ist bekannt, dass die Gene der Folattransportproteine FRα, RFC1 und PCFT in ihren regulatorischen Bereichen Bindungsstellen für Capicua enthalten. Dies führte zu der Annahme, dass CIC ein für den Folattransport relevantes Protein darstellt und eine Mutation in dessen Gen ursächlich für eine zerebrale Folatdefizienz sein kann. Untersucht wurden die Stopmutation p.R353X und die beiden Missense-Mutationen p.G580C und p.T990I. Es erfolgte die Generierung stabiler Zelllinien mittels Klonierung des CIC-Wildtyps und der Mutanten in einen Vektor mit GFP-Tag und lentiviraler Transduktion in HeLa-Zellen. Zur Charakterisierung der Mutanten wurden Immunfluoreszenzen, Western Blot-Analysen, qRT-PCR und radioaktive Bindungsassays durchgeführt. So wurde der Einfluss von CIC und dessen Mutationen auf die Lokalisation von CIC, die Expression von CIC und der Folattransportproteine FRα, RFC1 und PCFT sowie auf die Folsäurebindungsfähigkeit der Zellen untersucht und jeweils mit vektortransfizierten Zellen verglichen. In den Zellen des CIC-WT zeigte sich eine Hochregulation der FRα-Expression, die sowohl auf transkriptioneller Ebene als auch durch Nachweis erhöhter Proteinmenge nachgewiesen werden konnte. Die beiden Missense-Mutationen zeigten eine reduzierte Transkription des FOLR1-Gens, jedoch keine verminderte Expression des FRα-Proteins im Vergleich zum CIC-Wildtyp im Western Blot. Somit ergeben sich Hinweise auf eine geringgradige Funktionseinschränkung der FRα-Expression, die jedoch mit unseren Methoden nur teilweise dargestellt werden konnten. Die Stopmutation führte zur Expression eines verkürzten CIC-Proteins. Durch Verlust der Kernlokalisationssequenz kam es im Gegensatz zu den anderen Proteinvarianten, die die CIC-Lokalisation ausschließlich im ZK anzeigten, bei der Stopmutante zu einer ubiquitären Anreicherung des verkürzten Proteins in der Zelle. Die FRα-Expression in den Zellen der Stopmutante war signifikant vermindert. Wahrscheinlich ist ein Funktionsverlust des CIC-Proteins und eine supprimierende Wirkung auf das endogen exprimierte CIC, da FRα-Expression und Folsäurebindungsfähigkeit noch geringer waren als in den vektortransfizierten Zellen. In qRT-PCR und den Bindungsassays zeigten sich dazu kongruente Ergebnisse. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich auch mit einem alternativen Expressionssystem, in dem CIC ohne Fusion mit GFP exprimiert wurde. Weiterhin konnten die mit HeLa-Zellen durchgeführten Experimente mit Caco-2-Zellen bestätigt werden, sodass nicht von einem zelltypspezifischen Effekt auszugehen ist. Für die beiden Folattransportproteine RFC1 und PCFT zeigte sich kein Einfluss. CIC scheint somit als Aktivator für die Expression von FRα, nicht aber für RFC1 und PCFT zu fungieren.
Es bleibt zu untersuchen, welche genauen molekularen Mechanismen für den Einfluss von CIC auf den Folattransport eine Rolle spielen. Da es sich bei CIC um einen Transkriptionsfaktor handelt, der sich in den meisten Studien bisher als Suppressor der Transkription zeigte, ist ein indirekter Einfluss über andere Proteine möglich. Ein besseres Verständnis der Ursachen der Erkrankung sollte letztendlich ermöglichen, betroffene Patienten leichter zu identifizieren und eine frühzeitige und individuelle Therapie beginnen zu können. | de |
dc.description.abstracteng | In this dissertation, we studied the influence of the capicua protein on the expression of proteins that are involved in transcellular folate transport. To this end, various expressions of the capicua gene were studied: two missense mutations, one nonsense mutation, and the wildtype of the capicua gene were expressed in different cell lines, and the effect on the expression of further genes was compared. The three mutations were detected in patients with cerebral folate deficiency. This disease is characterized by a low concentration of 5-MTHF in the cerebrospinal fluid, concurrent with a normal hematogenous 5-MTHF level. The disease first manifests clinically in early infancy and may lead to progressive psychomotor retardation, movement disorders like ataxia, and epilepsy when untreated. MRI showed cerebellar and cerebral atrophy and focal demyelination in the white matter. Folate substitution is an effective therapy when started early. The above-mentioned patients did not show mutations in the genes classically associated with folate transport across the blood-brain barrier. However, genome sequencing revealed mutations in the CIC gene. The genes of the folate transport proteins FRα, RFC1, and PCFT all have a binding site for CIC in their regulatory regions. For this reason, a CIC mutation can cause a cerebral folate deficiency. The nonsense mutation p.R353X and the two missense mutations p.G580C and p.T990I were analyzed. Using lentiviral transduction, the mutations were transferred into HeLa cells. To characterize the mutations, immunofluorescences, western blot analyses, q-RT-PCR, and radioactive binding assays were performed. Thereby it was possible to investigate the influence of CIC and the CIC mutations on the localization of CIC, the expression of CIC and the folate transport proteins FRα, RFC1, and PCFT, as well as on the folate binding capacity of the cells. In the wild-type CIC, an upregulation of the expression of FRα was shown. The missense mutations led to a reduced transcription of the FOLR1 gene, but the expression of the FRα protein was equally high as in the wild-type CIC. While this suggests a low-grade functional limitation to the expression of FRα, which could only partially be detected with the present methodology. The nonsense mutation led to the expression of a truncated CIC protein. Due to the loss of the nuclear localization sequence, the truncated CIC protein accumulated ubiquitarily in the cell. In contrast, CIC was detected exclusively in the nucleus in all other cell lines. The expression of FRα was significantly reduced in the cells of the nonsense mutation. The nonsense mutation likely leads to a loss of function of the CIC protein. Further, the truncated protein seems to have a negative effect on the endogenous CIC, as the expression of FRα and the folate binding capacity were even lower than in empty vector-transfected cells. The results of the qRT-PCR and the binding assays were consistent with this finding. Similar results were obtained using a different vector and using a different cell line (Caco-2 cells). We did not detect any effects on the other folate transport proteins, RFC1 and PCFT. Thus, CIC seems to activate the expression of FRα but not of RFC1 or PCFT. Further studies should analyze the molecular mechanisms behind the influence of CIC on folate transport. As CIC has been shown to suppress transcription variously, further proteins could feasibly be involved in the activating function of CIC. A better understanding of the causes of the disease should ultimately enable easier identification of affected patients and allow for the initiation of early and individualized therapy. | de |
dc.contributor.coReferee | Kornak, Uwe Prof. Dr. | |
dc.subject.ger | Folat | de |
dc.subject.ger | Folattransport | de |
dc.subject.ger | CIC | de |
dc.subject.ger | Folatrezeptor | de |
dc.subject.ger | Zerebrale Folatdefizienz | de |
dc.subject.eng | folate | de |
dc.subject.eng | folate transport | de |
dc.subject.eng | cerebral folate transport | de |
dc.subject.eng | CIC | de |
dc.subject.eng | folate receptor | de |
dc.subject.eng | cerebral folate deficiency | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-ediss-15501-5 | |
dc.affiliation.institute | Medizinische Fakultät | de |
dc.subject.gokfull | Nachschlagewerke {Medizin} (PPN620300566) | de |
dc.subject.gokfull | Pädiatrie / Neonatologie / Kinderchirurgie - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619876093) | de |
dc.subject.gokfull | zerebraler Folattransport | de |
dc.description.embargoed | 2024-10-24 | de |
dc.identifier.ppn | 1906943141 | |
dc.notes.confirmationsent | Confirmation sent 2024-09-23T09:45:01 | de |