Einfluss medikamentöser Inhibition der anaplastischen Lymphomkinase auf die Regulation der mitochondrialen Apoptose in ALK+ anaplastisch großzelligen T-Zell Lymphomen

Influence of therapeutic inhibition of anaplastic lymphoma kinase on the regulation of mitochondrial apoptosis in ALK+ anaplastic large cell T-cell lymphomas

by Ann-Kathrin Brandherm
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-10-24
Date of issue:2024-10-08
Advisor:PD Dr. Raphael Koch
Referee:PD Dr. Raphael Koch
Referee:Prof. Dr. Dr. Philipp Brockmeyer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10786

 

 

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Name:06-10-2024 Dissertation Brandherm_A_FINAL zu...pdf
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Abstract

English

T-cell lymphomas are a rare, heterogeneous group of diseases of mature post-thymic T- or natural killer cells with primarily nodal or extranodal manifestation. The anaplastic large cell lymphoma (ALCL) can be classified into two subtypes, ALK-positive and ALK-negative, based on the presence or absence of a translocation involving the anaplastic lymphoma kinase (ALK). In ALK+ ALCL diseases, the most common translocation partner is nucleophposmin (NPM). The translocation results in the continuous autophosphorylation of the NPM-ALK fusion protein. This leads to downstream effects in various intracellular signaling pathways, resulting in independent cell proliferation and resistance to apoptosis. The prognosis is good for young patients. However, the 5-year progression-free survival rate for relapsed patients and patients with an initial high prognosis index is only 20 to 30 %. This results in the need for new therapeutic approaches. One approach to target ALK+ ALCL is to inhibit NPM-ALK activity using a tyrosine kinase inhibitor. The first-generation tyrosine kinase inhibitor Crizotinib achieved promising results in clinical trials, but not all patients achieved remission. Consequently, we will investigate the effects of two tyrosine kinase inhibitors, Crizotinib and Alectinib, in vitro, while also developing strategies to enhance therapeutic efficacy through combination approaches. Specifically, we will examine the potential mechanisms of apoptosis dysregulation that enable ALCL cells to survive despite ALK inhibition. Based on this, rational combination strategies to increase therapeutic efficacy will be developed, in particular the combination with the CD30 antibody-drug conjugate Brentuximab Vedotin (BV), which is already approved for this entity, will be tested. In viability measurements, the influence of ascending concentrations of Crizotinib and Alectinib on cell viability was described in vitro. Cell cycle analyses provided insights into cell number/cell death and cell cycle. Dynamic BH3-profiling provided insights into the mechanisms of mitochondrial apoptosis and showed an increased functional dependence on Bcl-xL and Mcl-1. Finally, the effects on the protein expression of the Bcl-2 family proteins were described in detail using Western blot analyses and on-target activity was demonstrated. Not all tested ALK+ ALCL cell lines showed a strong decrease in cell viability after treatment with the inhibitors; in some cell lines a residual population was observed. After Crizotinib incubation, the percentage of the G0/G1 phase decreased in all tested cell lines. An increased dependence of the ALK+ ALCL cell lines on the anti-apoptotic proteins Mcl-1 and Bcl-xL was observed after Crizotinib incubation. Western blot analyses demonstrated on-target activity by decreasing pALK protein expression. In addition, the Western blot analyses showed a decrease in protein expression of the pro-apoptotic Mcl-1 antagonist NOXA despite persistence of the Mcl-1 protein. The combination of the Bcl-xL inhibitor ABT263 and Crizotinib demonstrated low viability-inhibiting and synergistic effects. In contrast, the combination of the Mcl-1 inhibitor AZD5991 and Crizotinib exhibited significant antiproliferative and synergistic effects. Considering the clinical relevance and potential effects of the antibody-drug conjugate BV on anti-apoptotic Bcl-2 family members, a combination strategy involving BV and either Crizotinib or Alectinib was subsequently explored. BV significantly reduced the viability of the tested cell line in combination with Crizotinib and Alectinib. Further cell cycle analyses showed that more cell death was induced than by the drugs Crizotinib and BV individually. Due to the distinct mechanisms of action of the two drugs within the cell cycle, a sequential treatment approach was developed. The effectiveness of the combination Crizotinib/BV was increased in one cell line compared to single-drug treatment and more apoptosis was induced. In summary, the combination of AZD-5991/Crizotinib and BV/Crizotinib can be considered promising. In vivo testing of the BV and Crizotinib combination is necessary to verify these results and assess their clinical applicability, particularly in relation to the concept of sequential treatment.
Keywords: t-cell lymphoma; ALK+; ALCL; Crizotinib; Alectinib; BV; ABT263; AZD-5991; mitochondrial apoptosis

German

T-Zell Lymphome sind eine seltene, heterogene Gruppe an Erkrankungen reifer post-thymischer T- oder natürlicher Killer-Zellen mit primär nodaler oder extranodaler Manifestation. Der Subtyp anaplastisches, großzelliges Lymphom (ALCL) kann anhand einer Translokation der anaplastischen Lymphomkinase (ALK) in ALK+ und ALK- unterschieden werden. In ALK+ ALCL-Erkrankungen ist der häufigste Translokationspartner Nucleophposmin (NPM). Aufgrund der beschriebenen Translokation kommt es zu einer konstitutiven Autophosphorylierung des NPM-ALK Fusionsproteins. Daraus resultieren downstream-Effekte verschiedener intrazellulärer Signalkaskaden mit den Folgen einer unabhängigen Zellproliferation und Apoptoseresistenz. Für junge erkrankte Patienten ist die Prognose gut. Die 5-Jahres progressionsfreie Überlebensrate liegt für rezidivierte Patienten und Patienten mit initialem hohen Prognoseindex jedoch bei nur 20 bis 30 %. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit neuer Therapieansätze. Eine Möglichkeit eine ALK+ ALCL-Erkrankung zu adressieren ist eine Inhibition der NPM-ALK Aktivität mit einem Tyrosinkinasen-Inhibitor. Der Tyrosinkinasen-Inhibitor der ersten Generation Crizotinib erzielte in klinischen Studien vielversprechende Ergebnisse, dennoch erreichten nicht alle Patienten eine Remission. Deswegen sollen in dieser Arbeit die Effekte von zwei Tyrosinkinasen-Inhibitoren – Crizotinib und Alectinib - in vitro untersucht und Strategien zur Verstärkung der therapeutischen Effektivität durch Kombinationsstrategien entwickelt werden. Hierfür sollen insbesondere mögliche Mechanismen der Apoptosedysregulation, die zum Überleben der ALCL-Zellen unter ALK-Inhibition beitragen, analysiert werden. Darauf aufbauend sollen rationale Kombinationsstrategien zur Steigerung der therapeutischen Effektivität entwickelt werden, besonders soll die Kombination mit dem bereits für diese Entität zugelassenen CD30 Wirkstoff-Antikörper-Konjugat Brentuximab Vedotin (BV) geprüft werden. In Viabilitätsmessungen wurde in vitro die Beeinflussung der Zellviabilität unter aufsteigenden Konzentrationen von Crizotinib und Alectinib beschrieben. Durch die Zellzyklus-Analysen wurden Erkenntnisse zu Zellzahl/Zelltod und Stadium des Zellzyklus gewonnen. Mittels dynamischem BH3-profiling konnten Einblicke in die Mechanismen der mitochondrialen Apoptose ermöglicht werden und eine gesteigerte funktionelle Abhängigkeit von Bcl-xL und Mcl-1 gezeigt werden. Abschließend wurden mit Western Blot-Analysen die Effekte auf die Proteinexpression der Proteine der Bcl-2 Familie näher beschrieben und eine on-target Aktivität nachgewiesen. Nicht alle getesteten ALK+ ALCL-Zelllinien zeigten eine starke Abnahme der Zellviabilität nach Behandlung mit den Inhibitoren, teils konnte die Ausbildung einer residuellen Population beobachtet werden. Nach Crizotinib Inkubation nahm in allen getesteten Zelllinien der prozentuale Anteil der G0/G1-Phase ab. Es konnte eine gesteigerte Abhängigkeit der verwendeten ALK+ ALCL-Zelllinien von den anti-apoptotischen Proteinen Mcl-1 und Bcl-xL nach Crizotinib Inkubation festgestellt werden. In Western Blot-Analysen wurde anhand einer abnehmenden pALK-Proteinexpression die on-target Aktivität nachgewiesen werden. Darüber hinaus zeigten die Western Blot-Analysen eine abnehmende Proteinexpression des pro-apoptotischen Mcl-1 Antagonisten NOXA trotz Persistenz des Proteins Mcl-1. Für die Kombination Bcl-xL Inhibitor ABT263/Crizotinib wurden geringe viabilitätshemmende und synergistische Effekten beschrieben. Die Kombination Mcl-1 Inhibitor/Crizotinib zeigte starke antiproliferative Effekte und synergistische Effekte. Im Hinblick auf eine klinische Anwendbarkeit sowie putative Effekte des Antiköper-Wirkstoff-Konjugats BV auf anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglieder wurde nachfolgend eine Kombinationsstrategie von BV mit Crizotinib oder Alectinib untersucht. BV reduzierte die Viabilität der getesteten Zelllinie in Kombination mit Crizotinib und Alectinib deutlich. In weiterführenden Zellzyklus-Analysen konnte gezeigt werden, dass mehr Zelltod induziert werden konnte als durch die Medikamente Crizotinib und BV einzeln betrachtet. Aufgrund des unterschiedlichen Angriffspunkts im Zellzyklus der beiden Medikamente wurde das Konzept der sequenziellen Behandlung entwickelt. Die Effektivität der Kombination Crizotinib/BV konnte in einer Zelllinien im Vergleich zur einzeitigen Behandlung gesteigert und mehr Apoptose induziert werden. Zusammenfassend kann die Kombination AZD-5991/Crizotinib und BV/Crizotinib als vielversprechend gewertet werden. Es benötigt eine in vivo Prüfung der Kombination BV und Crizotinib zum Verifizieren dieser Ergebnisse und Testung der klinischen Umsetzbarkeit v. a. bezogen auf das Konzept der sequenziellen Behandlung.
Schlagwörter: ALCL; ALK+; T-Zell Lymphom; Crizotinib; Alectinib; ABT263; AZD-5991; Mitochondriale Apoptose