Etablierung neuer Biomarker für die Differenzierung von malignen Keimzelltumoren des Hodens
Establishment of new biomarkers for the differentiation of malignant testicular germ cell tumors
by Yasmine Maatoug
Date of Examination:2024-10-23
Date of issue:2024-10-11
Advisor:PD Dr. Felix Bremmer
Referee:PD Dr. Felix Bremmer
Referee:PD Dr. Annemarie Uhlig
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10790
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Abstract
English
Testicular germ cell tumors (TGCTs) are the most common malignant tumors in young men between the ages of 25 and 45. They account for approximately 90 % of testicular tumors and are divided into seminomas and non-seminomas. The two subgroups differ in their histological and macroscopic appearance, moreover they form mixed tumors. In particular, the various histological subtypes differ in terms of therapy. Although many biomarkers are already used for differentiation, precise histological subtyping can be difficult in individual cases. In addition, there are still uncertainties regarding the biological behavior of the various histological subtypes. The aim of this study was, on the one hand, to detect new biomarkers that allow the differentiation of seminomas and embryonal carcinomas (a type of non-seminoma). On the other hand, possible proteins were to be detected, that could provide information about the different biological behavior of these tumors. SILAC-based mass spectrometry (MS) proved to be a suitable method for quantifying the proteomes of the different model cell lines, TCam-2, a model cell line with the characteristics of seminoma, and NTERA-2, a model cell line with the characteristics of embryonal carcinoma. SILAC-MS was used to detect proteins that are expressed at different levels in the two different cell lines. 121 proteins were upregulated in the TCam-2 cell line with a ratio > 2. 70 proteins were expressed at least twofold higher in NTERA-2. Further analyses were carried out based on two selected proteins per cell line. With the help of database research on the differentially highly expressed proteins, CD81 and CBX-3 were selected as examples for TCam-2 and PHF-6 and ENSA as examples for NTERA-2. The results of the SILAC-based mass spectrometric analysis were verified in-vitro using Western blot analyses. In subsequent immunohistochemical studies on tumor-free testicular tissue and TGCT tissue, these results were transferred from in-vitro analyses to human tissue. Using immunohistochemical staining, it was shown that CD81 and CBX-3 can serve as markers for Germ cell neoplasia in situ (GCNIS) or seminoma. PHF-6 proved to be a potential marker for GCNIS and embryonal carcinoma. ENSA can serve as a weaker potential marker for embryonal carcinoma compared to PHF-6. SILAC-supported MS is therefore suitable for the detection of new biomarkers. In further investigations with siRNA, a significant decrease in the proliferation of cell lines was observed by knocking out the analysed proteins. Further investigations of these proteins should be carried out particularly regarding tumor proliferation and new therapeutic methods.
Keywords: SILAC; mass spectrometry; quantitative proteomics; CD81; CBX-3; PHF-6; ENSA; Testicular germ cell tumor; seminoma; non-seminoma; embryonal carcinoma; Tcam-2; Ntera-2; NCCIT; siRNA; protein-knockdown
German
Testikuläre Keimzelltumoren (TKZT) sind die häufigsten malignen Tumoren des jungen Mannes zwischen dem 25. und dem 45. Lebensjahr. Sie machen ca. 90 % der Hodentumoren aus und werden in Seminome und Nichtseminome unterteilt. Die beiden Untergruppen weisen Unterschiede in ihrer histologischen und makroskopischen Erscheinung auf und bilden zudem Mischtumoren aus. Insbesondere unterscheiden sich die verschiedenen histologischen Subtypen hinsichtlich der Therapie. Zwar wird bereits eine Vielzahl von Biomarkern zur Differenzierung herangezogen, die genaue histologische Subtypisierung kann jedoch in einzelnen Fällen erschwert sein. Darüber hinaus bestehen immer noch Unklarheiten hinsichtlich des biologischen Verhaltens der verschiedenen histologischen Subtypen. Ziel der vorliegenden Arbeit war einerseits, neue Marker zu detektieren, die eine Differenzierung von Seminomen und Embryonalen Karzinomen erlauben. Andererseits sollten mögliche Proteine detektiert werden, die Aufschluss über das unterschiedliche biologische Verhalten dieser Tumoren geben können. Die SILAC gestützte Massenspektometrie (MS) erwies sich als geeignete Methode die Proteome der unterschiedlichen Modellzelllinien, TCam-2, einer Modellzellinie mit den Eigenschaften Seminoms, und NTERA-2, einer Modellzelllinie mit den Eigenschaften des Embryonalen Karzinoms, zu quantifizieren. Mittels SILAC-MS wurden Proteine detektiert, die in den beiden unterschiedlichen Zelllinien unterschiedlich hoch exprimiert werden. 121 Proteine waren in der TCam-2 Zelllinie, mit einer Ratio > 2 hochreguliert. 70 Proteine waren mindestens zweifach erhöht in NTERA-2 expremiert. Anhand von je zwei ausgewählten Proteinen pro Zelllinie erfolgten weitere Untersuchungen. Mit Hilfe von Datenbankrecherchen zu den unterschiedlich hoch exprimierten Proteinen wurden CD81 und CBX-3 beispielhaft für TCam-2 sowie PHF-6 und ENSA beispielhaft für NTERA-2 ausgewählt. Die Ergebnisse der SILAC gestützten massenspektrometrischen Untersuchung konnten in-vitro mittels Western-Blot-Analysen verifiziert werden. In anschließenden immunhistochemischen Untersuchungen an tumorfreien Hodengewebe und TKZT-Gewebe sind diese Ergebnisse von in-vitro - Analysen auf humanes Gewebe übertragen worden. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurde gezeigt, dass CD81 und CBX-3 als Marker für GCNIS oder Seminome dienen kann. PHF-6 erwies sich als potenzieller Marker für GCNIS und Embryonales Karzinom. ENSA kann im Vergleich zu PHF-6 als schwächerer potenzieller Marker für Embryonales Karzinom dienen. Die SILAC gestützte MS eignet sich demnach zur Detektion von neuen Biomarkern. In weiterführenden Untersuchungen mit siRNA, wurde durch Knockout der untersuchten Proteine ein signifikanter Rückgang der Proliferation der Zellllinien beobachtet. Weitere Untersuchungen dieser Proteine sollten im Hinblick auf Tumorproliferation und neue Therapieverfahren erfolgen.
Schlagwörter: SILAC; Massenspektrometrie; Quantitative Proteomik; CD81; CBX-3; PHF-6; ENSA; Testikuläre Keimzelltumoren; Seminome; Nichtseminome; Embryonales Karzinom; Tcam-2; Ntera-2; NCCIT; siRNA; Proteinknockout
