Der Effekt der H3.3K27M-Mutation auf die Antitumorwirkung von Curcumin
Effects of the H3.3K27M mutation on the antitumor activity of curcumin
by Maren Hambach
Date of Examination:2024-10-29
Date of issue:2024-10-14
Advisor:Prof. Dr. Christof Kramm
Referee:Prof. Dr. Elisabeth Heßmann
Referee:Prof. Dr. Holger Bastians
Referee:Prof. Dr. Ralf Dressel
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Abstract
English
Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) are pediatric high-grade glioma (pedHGG) with a median overall survival of 11 months after diagnosis. The aggressiveness of this tumor entity appears to be further increased in the presence of an H3.3K27M mutation in some pedHGG subtypes, leading to a global loss of trimethylation and increased acetylation at H3K27. Due to this poor prognosis and the lack of innovative therapeutic strategies, parents resort to alternative medicine, such as curcumin, to treat their children. The present study investigates the effects of curcumin in dependence of the H3.3K27M mutation status on tumor cells in vitro and in the chorioallantoic-membrane (CAM)- assay on CAM-tumors in vivo. For this purpose, isogenic TUGO-1 cells were used (originally derived from a pedHGG, IDH and H3 WT, with a cellular origin that is now retrospectively no longer detectable beyond doubt), which differ only in their H3.3K27M mutation status. In the MTT cell viability assay, treatment of isoTUGO-1 cells with curcumin led to a dose-dependent reduction in cell viability with a slightly stronger effect on H3.3K27M-mutated isoTUGO-1 cells in vitro. Statistically, curcumin also significantly reduced the tumor volume of isoTUGO-1-CAM Tumors in vivo with a stronger effect of curcumin on H3WT-isoTUGO-1-CAM tumors. The growth inhibitory effect of curcumin both in vitro and in vivo was reflected by a significant but H3 mutation-independent reduction of the protooncogene and proliferation marker MYC. In addition, curcumin reduced the stem cell character of isoTUGO-1 cells and -CAM tumors by inhibiting the self-renewal potential of isoTUGO-1 cells in the sphere formation assay in an H3 mutation-independent manner and led to a significantly reduced mRNA-expression of the stem cell markers POU5F1 and NES in H3WT and H3.3K27M-mutated isoTUGO-1 cells and -CAM tumors and PROM1 in H3WT-isoTUGO-1 cells and -CAM tumors. Since the standard treatment of DIPG consists of radiochemotherapy with or without TMZ, the effect of the concomitant administration of curcumin alongside standard therapy on cell viability was investigated. Regardless of H3.3K27M mutation status, curcumin did not result in any sensitization of isoTUGO-1 cells towards chemotherapy with TMZ or radiation in vitro. In vivo as well, the combination of curcumin with irradiation did not lead to a sensitizing effect. The migration and invasion ability of isoTUGO-1 cells was investigated in vitro by performing cell migration and invasion experiments, and in vivo in the CAM-assay in dependence of the H3.3K27M mutation status. Treatment of isoTUGO-1 cells with curcumin led to a reduction in migration and invasion ability in vitro, with curcumin having a significantly stronger inhibitory effect on H3.3K27M-mutated isoTUGO-1 cells. In vivo, the invasion of isoTUGO-1-CAM tumors was also significantly reduced by curcumin-treatment, with a stronger effect on H3WT-isoTUGO-1-CAM tumors. This reduction in migration and invasion ability of isoTUGO-1 cells and -CAM-tumors was reflected by a significant reduction of the mRNA expression of the migration- and invasion-associated genes MMP2, MMP7, MMP9 and VEGFA in isoTUGO-1-cells and CAM-tumors. In conclusion, curcumin shows a significant tumor inhibitory effect on isoTUGO-1 cells and -CAM-tumors, which could be explained by its pleiotropic effects on multiple signaling pathways. Due to its low toxicity, curcumin could be a promising adjuvant therapeutic agent in pedHGG antitumor therapy. However, its low bioavailability in its current form limits its clinical application, making the development of efficient transport strategies for curcumin necessary.
Keywords: Curcumin; Diffuse intrinsic pontine glioma; Pediatric high-grade glioma; H3.3K27M
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Diffus intrinsische Ponsgliome (DIPG) sind pädiatrisch hochgradige Gliome (pädHGG) mit einer medianen Gesamtüberlebensdauer von 11 Monaten nach Diagnosestellung. Die Aggressivität dieser Tumorentität scheint bei Vorliegen einer H3.3K27M-Mutation in einigen pädHGG-Subtypen noch weiter gesteigert, welche zu einem globalen Verlust der Trimethylierung, begleitet von einer erhöhten Acetylierung an H3K27 führt. Aufgrund dieser infausten Prognose und dem Mangel innovativer Therapiestrategien greifen Eltern zur Behandlung ihrer Kinder auf alternativmedizinische Produkte wie Curcumin zurück.
Die vorliegende Studie untersucht die Effekte von Curcumin in Abhängigkeit des H3.3K27M-Mutationsstatus auf Tumorzellen in vitro sowie im Chorioallantoismembran (CAM)-Versuch auf CAM-Tumore in vivo. Dafür wurden isogene TUGO-1-Zellen genutzt (die ursprünglich von einem pädHGG, IDH- und H3 WT stammen, dessen zellulärer Ursprung sich retrospektiv allerdings nicht mehr zweifelsfrei nachweisen lässt), welche sich lediglich in ihrem H3.3K27M-Mutationsstatus unterschieden.
Im MTT-Zellviabilitätsversuch führte die Behandlung der isoTUGO-1-Zellen mit Curcumin zu einer dosisabhängigen Reduktion der Zellviabilität mit einem leicht stärkeren Effekt auf H3.3K27M-mutierte isoTUGO-1-Zellen in vitro. Auch in vivo reduzierte Curcumin das Tumorvolumen von isoTUGO-1-CAM-Tumoren statistisch signifikant, mit einem stärkeren Effekt von Curcumin auf H3WT-isoTUGO-1-CAM-Tumore. Die wachstumsinhibierende Wirkung von Curcumin in vitro und in vivo wurde durch eine signifikante, aber H3-mutationsunabhängige Reduktion des Protoonkogens und Proliferationsmarkers MYC reflektiert.
Zudem führte Curcumin zu einer Reduktion des Stammzellcharakters von isoTUGO-1-Zellen und -CAM-Tumoren, indem es H3-mutationsunabhängig das Selbsterneuerungspotential von isoTUGO-1-Zellen im Sphärenformationsversuch inhibierte und zu einer signifikant reduzierten mRNA-Expression der Stammzellmarker POU5F1 und NES in H3WT- und H3.3K27M-mutierten isoTUGO-1-Zellen und -CAM-Tumoren und PROM1 in H3WT-isoTUGO-1-Zellen und -CAM-Tumoren führte.
Da die Standardbehandlung des DIPG aus einer Radiochemotherapie mit oder ohne TMZ besteht, wurde der Effekt der konkomitanten Gabe von Curcumin zusätzlich zu der Standardtherapie auf die Zellviabilität untersucht. Hierbei führte Curcumin unabhängig des H3.3K27M-Mutationsstatus zu keiner Sensibilisierung der isoTUGO-1-Zellen gegenüber der Chemotherapie mit TMZ oder der Bestrahlung in vitro. Auch in vivo führte die Kombination von Curcumin mit der Bestrahlung zu keinem sensibilisierenden Effekt.
Die Migrations- und Invasionsfähigkeit der isoTUGO-1-Zellen wurde in vitro durch die Exekution von Zellmigrations- und Invasionsversuchen sowie in vivo im CAM-Versuch in Abhängigkeit des H3.3K27M-Mutationsstatus untersucht. Die Behandlung der isoTUGO-1-Zellen mit Curcumin führte in vitro zu einer Reduktion der Migrations- und Invasionsfähigkeit, wobei Curcumin einen signifikant stärker inhibierenden Effekt auf H3.3K27M-mutierte isoTUGO-1-Zellen hatte. Auch in vivo konnte die Invasion von isoTUGO-1-CAM-Tumoren durch die Behandlung mit Curcumin signifikant reduziert werden, mit einem stärkeren Effekt auf H3WT-isoTUGO-1-CAM-Tumore. Diese Reduktion der Migrations- und Invasionsfähigkeit von isoTUGO-1-Zellen und -CAM-Tumoren wurde durch eine signifikante Reduktion der mRNA-Expression der migrations- und invasionsassoziierten Gene MMP2, MMP7, MMP9 und VEGFA in isoTUGO-1-Zellen und -CAM-Tumoren reflektiert.
Zusammenfassend zeigt Curcumin eine signifikante tumorinhibitorische Wirkung auf isoTUGO-1-Zellen und -CAM-Tumoren, die durch seine pleiotropen Effekte auf multiple Signalwege erklärt werden könnte. Aufgrund der niedrigen Toxizität könnte Curcumin ein vielversprechendes adjuvantes Therapeutikum in der pädHGG-Antitumortherapie sein. Allerdings limitiert die geringe Bioverfügbarkeit in der aktuellen Form seine klinische Anwendung, weshalb die Entwicklung effizienter Transportstrategien für Curcumin notwendig ist.
Schlagwörter: Curcumin; Diffus intrinsisches Ponsgliom; Pädiatrisch hochgradige Gliome; H3.3K27M