Genotype effect on Norway spruce (Picea abies) mycobiome and resistance against Heterobasidion parviporum under abiotic stress

by Blessing Adeola Durodola
Doctoral thesis
Date of Examination:2023-08-31
Date of issue:2024-11-05
Advisor:Dr. Eeva-Liisa Terhonen
Referee:Dr. Eeva-Liisa Terhonen
Referee:Prof. Dr. Oliver Gailing
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10822

 

 

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Abstract

English

Norway spruce (Picea abies L. Karst.) holds considerable economic importance as a tree species in Europe. However, it faces significant vulnerability to attacks from the Heterobasidion annosum species complex, resulting in estimated annual losses of around 800 € million in Europe. Norway spruce exhibits limited resilience and restorative capabilities under changing climatic conditions, making it susceptible to both biotic and abiotic stresses. As climate patterns, particularly temperature and precipitation, are expected to undergo alterations, the geographic distribution and suitable habitats required for Norway spruce may experience substantial changes. Therefore, comprehending the underlying mechanisms involved in how trees respond to pathogenic attacks could prove beneficial in addressing this issue. The first chapter described a transcriptional study comparing Norway spruce gene expressions to evaluate the effects of water availability and infection with Heterobasidion parviporum. In this study, RNA-seq analysis was conducted on Norway spruce samples to identify the genetic pathways associated with specific responses to adverse environmental stress (drought) both in the presence and absence of the pathogen H. parviporum. Additionally, a transcriptional study was implemented to examine the interaction between H. parviporum infection and the expression of defense-related genes influenced by drought stress. Eighteen seedlings were randomly assigned to water treatment groups (high or low) and inoculated with H. parviporum, mock-inoculated (2% Malt extract agar) or left untreated. Four candidate genes were successfully identified (MA_110169g0010, MA_14707g0010, MA_15852g0010, MA_10427673g0020) to be associated with resistance against Heterobasidion sp., especially under drought. These genes exhibited significant expression changes, either higher or lower, compared to the non-treated control group, exclusively in H. parviporum-infected plants. However, we also observed that the defense-related gene response becomes more intricate when additional abiotic stress factors are present. These findings indicate that water availability plays a crucial role in determining the gene regulation strategy (upregulation or downregulation) employed by H. parviporum-infected Norway spruce. Moreover, our results suggest that Norway spruce exhibits a preferential defense response to H. parviporum infection rather than physical wounding, depending on the prevailing water availability conditions. The second chapter examined the genetic variation of Picea abies in response to the artificial inoculation of Heterobasidion parviporum infection. Inoculation experiments were performed to assess how different families of Norway spruce seedlings respond to Heterobasidion parviporum infection under abiotic stress. Eight hundred Norway spruce seedlings were categorised based on two water treatments. Four hundred seedlings received the optimum watering required for their growth and survival, while the remaining four hundred received half the optimum watering. Inoculations were done with two strains of H. parviporum. The seedlings were inoculated with either H. parviporum strains (Hpa 1 and Hpa 2) or 1.5% MEA as a control, others were left untreated. The growth parameters and lesions in both phloem and sapwood were measured. The results show that the seedlings' height, unlike the diameter, was not impacted by water stress nor inoculation treatment but by families and genotypes. Strong positive correlations were also observed between the lesion sizes in both phloem and sapwood. Overall, the study elucidates the influence of Norway spruce genotypes on growth dynamics and that the induced response patterns of Picea abies to artificial inoculations by different strains of the same pathogen could be different. The third chapter explored the mycobiome of Norway spruce and gave insights into the fungal communities and their diversity and stability under abiotic stress and Heterobasidion parviporum infection. As part of a continued effort to understand the effects of host genetics and environmental factors on fungal composition and evaluate the "mycobiome-associatedfitness" hypothesis, a comparative analysis was carried out. Sixty-seven Norway spruce seedlings either inoculated with H. parviporum, mock-inoculated or left untreated were used for this study. The seedlings were grouped into optimum and low watering categories, and the mycobiome associated with phloem and roots were analysed. The findings underscore the variations in the diversity and abundance of mycobiome genera in Norway spruce genotypes and response to water availability in the phloem. There were varying degrees of necrosis across Norway spruce genotypes, and the presence of one fungus influenced the abundance of another: in the case of Heterobasidion-Phialocephala. Key fungi such as Phialocephala fortinii and Paraphaeosphaeria neglecta were identified in the root mycobiome to confer inhibitory benefits to Norway spruce against the growth of Heterobasidion parviporum. Furthermore, specific endophytes exhibited greater stability under low water availability in the roots than ectomycorrhizal fungi. The study suggests that Norway spruce resistance against pathogens (Heterobasidion parviporum) is shaped by a complex interplay of several factors, including genetic and environmental factors such as soil moisture levels and fungal adaptability. The fourth chapter assessed the Leucoanthocyanidin Reductase 3 (PaLAR3) locus in Norway spruce (Picea abies) and its link to resistance against Heterobasidion parviporum. The presence of the B allele at the PaLAR3 locus potentially confers enhanced resistance against pathogens in inoculation experiments. This research examined the impact of the PaLAR3 gene on necrosis development induced by H. parviporum in the stems of Norway spruce clonal materials under different watering conditions. Seven hundred and fifty-four clonal Norway spruce seedlings used for this study were either inoculated with H. parviporum strains, mockinoculated or left untreated. Designed PaLAR3 locus-specific primers were used to detect PaLAR3 alleles in the Seven hundred and fifty-four seedlings. The outcome shows that the homozygous PaLAR3B allele is present in lower quantities as compared to its heterozygous counterpart or the PaLAR3A, which was the most abundant. Also, there was an interaction between the necrotic area and the homozygous PaLAR3BB under conditions of reduced water availability. The findings support previous research that the PaLAR3B allele could serve as one of the valuable markers for identifying resistance in the Picea abies-Heterobasidion pathosystem. All in all, for Norway spruce, the concept of plants extended genotypic variation against pathogens and inherent mycobiome should be considered as factors to be included in resistance studies.
Keywords: Fungi-host relationship; Drought stress; Genotypic variation; Forest Pathology; Mycobiome

German

Die Gemeine Fichte (Picea abies L. Karst.) hat als Baumart in Europa eine erhebliche wirtschaftliche Bedeutung. Er ist jedoch sehr anfällig für Infektionen mit dem Artenkomplex Heterobasidion annosum, die in Europa zu geschätzten jährlichen Verlusten von rund 800 Mio. EUR führen. Die Gemeine Fichte weist unter wechselnden klimatischen Bedingungen eine begrenzte Widerstandsfähigkeit und Wiederherstellungsfähigkeit auf, was sie sowohl für biotischen als auch für abiotischen Stress anfällig macht. Da sich die Klimamuster, insbesondere die Temperatur und die Niederschläge, voraussichtlich verändern werden, können sich die geografische Verteilung und die geeigneten Lebensräume, die für die Fichte erforderlich sind, erheblich ändern. Daher könnte sich das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen, die daran beteiligt sind, wie Bäume auf pathogene Angriffe reagieren, als vorteilhaft erweisen, um dieses Problem anzugehen. Die erste Arbeit beschreibt eine transkriptionelle Studie, in der die Genexpression der Gemeine Fichte verglichen wurde, um die Auswirkungen der Wasserverfügbarkeit und der Infektion mit Heterobasidion parviporum zu bewerten. In dieser Studie wurde eine RNA-SeqAnalyse an Fichtenproben durchgeführt, um die genetischen Signalwege zu identifizieren, die mit spezifischen Reaktionen auf widrigen Umweltstress (Trockenheit) sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des Erregers H. parviporum verbunden sind. Zusätzlich wurde eine Transkriptionsstudie durchgeführt, um die Interaktion zwischen H. parviporum-Infektion und die Expression von Abwehrgenen, die durch Trockenstress beeinflusst werden zu untersuchen. Achtzehn Sämlinge wurden nach dem Zufallsprinzip in Wasserbehandlungsgruppen (hoch oder niedrig) eingeteilt und mit H. parviporum beimpft., scheingeimpft (2%iger MalzextraktAgar) oder unbehandelt. Vier Kandidatengene (MA_110169g0010, MA_14707g0010, MA_15852g0010, MA_10427673g0020) konnten erfolgreich identifiziert werden, die mit einer Resistenz gegen Heterobasidion sp., insbesondere unter Trockenheit, assoziiert sind. Diese Gene zeigten signifikante Expressionsänderungen, entweder höher oder niedriger, im Vergleich zur nicht behandelten Kontrollgruppe, ausschließlich in H. parviporum-infizierten Pflanzen. Wir beobachteten jedoch auch, dass die abwehrbezogene Genantwort komplizierter wird, wenn zusätzliche abiotische Stressfaktoren vorhanden sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wasserverfügbarkeit eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Genregulationsstrategie (Hoch- oder Herunterregulierung) von H. parviporum-infizierte Gemeine Fichte spielt. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Gemeine Fichte eine präferentielle Abwehrreaktion auf H. parviporum-Infektion, statt physischer Verletzung, zeigt, abhängig von den vorherrschenden Wasserverfügbarkeitsbedingungen. Die zweite Arbeit untersucht die genetische Variation von Picea abies als Reaktion auf die künstliche Inokulation von Heterobasidion parviporum-Infektionen. Es wurden Inokulationsexperimente durchgeführt, um zu untersuchen, wie verschiedene Familien von Fichtensämlingen auf eine Infektion mit H. parviporum unter abiotischem Stress reagieren. Achthundert Fichtensämlinge wurden anhand von zwei Wasserbehandlungen kategorisiert. Vier hundert Sämlinge erhielten die optimale Bewässerung, die für ihr Wachstum und Überleben erforderlich war, während die restlichen vier hundert die Hälfte der optimalen Bewässerung erhielten. Die Inokulationen wurden mit zwei H. parviporum-Stämmen durchgeführt. Die Sämlinge wurden entweder mit H. parviporum-Stämmen beimpft (Hpa 1 und Hpa 2) oder 1,5 % MEA als Kontrolle. Andere blieben unbehandelt. Die Wachstumsparameter und Läsionen sowohl im Phloem als auch im Splintholz wurden gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Höhe der Sämlinge, im Gegensatz zum Durchmesser, nicht durch Wasserstress oder Impfbehandlung, sondern durch Familien und Genotypen beeinflusst wurde. Starke positive Korrelationen wurden auch zwischen den Läsionsgrößen sowohl im Phloem als auch im Splintholz beobachtet. Insgesamt verdeutlicht die Studie den Einfluss von Fichtengenotypen auf die Wachstumsdynamik und dass die induzierten Reaktionsmuster von Picea abies auf künstliche Inokulationen durch verschiedene Stämme desselben Erregers unterschiedlich sein könnten. Die dritte Arbeit untersucht das Mykobiom der Gemeine Fichte und gibt Einblicke in die Pilzgemeinschaften und ihre Diversität und Stabilität unter abiotischem Stress und Heterobasidion parviporum-Infektionen. Im Rahmen der kontinuierlichen Bemühungen, die Auswirkungen der Wirtsgenetik und der Umweltfaktoren auf die Pilzzusammensetzung zu verstehen und die Hypothese der "Mykobiom-assoziierten Fitness" zu bewerten, wurde eine vergleichende Analyse durchgeführt. Siebenundsechzig Fichtensämlinge wurden für diese Studie entweder mit H. parviporum beimpft, scheininokuliert oder unbehandelt verwendet. Die Sämlinge wurden in optimale und niedrige Bewässerungskategorien eingeteilt und das Mykobiom mit ihren Phloemen und Wurzeln analysiert. Die Ergebnisse unterstreichen die Unterschiede in der Vielfalt und Häufigkeit von Mykobiom-Gattungen in den Genotypen der Gemeine Fichte und in der Reaktion auf die Wasserverfügbarkeit im Phloem. Es gab unterschiedliche Grade der Nekrose zwischen den Genotypen der Gemeine Fichte, und das Vorhandensein des einen Pilzes beeinflusste die Häufigkeit des anderen; wie hier im Falle von Heterobasidion-Phialocephala. Schlüsselpilze wie Phialocephala fortinii und Paraphaeosphaeria neglecta wurden im Wurzelmykobiom identifiziert, um der Fichte hemmende Vorteile gegen das Wachstum von Heterobasidion parviporum zu verleihen. Darüber hinaus zeigten bestimmte Endophyten eine höhere Stabilität bei geringer Wasserverfügbarkeit in den Wurzeln als Ektomykorrhizapilze. Die Studie legt nahe, dass die Resistenz der Fichte gegen Krankheitserreger (Heterobasidion parviporum) durch ein komplexes Zusammenspiel mehrerer Faktoren geprägt ist, darunter genetische und umweltbedingte Faktoren wie Bodenfeuchte und Anpassungsfähigkeit von Pilzen. Die vierte Arbeit untersucht den Leucoanthocyanidin Reductase 3 (PaLAR3) Locus in der Gemeine Fichte (Picea abies) und seinen Zusammenhang mit der Resistenz gegen H. parviporum. Das Vorhandensein des B-Allels am PaLAR3-Locus führt möglicherweise zu einer erhöhten Resistenz gegen Krankheitserreger in Inokulationsexperimenten. In dieser Arbeit wurde der Einfluss des PaLAR3-Gens auf die durch H. parviporum induzierte Nekroseentwicklung in den Stängeln von Klonmaterialien der Gemeine Fichte unter verschiedenen Bewässerungsbedingungen untersucht. Sieben hundert vier und fünfzig klonale Fichtensämlinge, die für diese Studie verwendet wurden, wurden entweder mit H. parviporumStämmen inokuliert, die vorgetäuscht oder unbehandelt bleiben. Entworfene PaLAR3-Locusspezifische Primer wurden verwendet, um PaLAR3-Allele in den Sieben hundert vier und fünfzig Keimlingen nachzuweisen. Das Ergebnis zeigt, dass das homozygote PaLAR3B-Allel in geringeren Mengen vorhanden ist als sein heterozygotes Gegenstück oder das PaLAR3A, das am häufigsten vorkam. Es gab auch eine Interaktion zwischen dem nekrotischen Bereich und dem homozygoten PaLAR3BB unter Bedingungen reduzierter Wasserverfügbarkeit. Die Ergebnisse unterstützen das PaLAR3B-Allel als wertvollen Marker für die Identifizierung von Resistenzen im Heterobasidion-Pathosystem von Picea abies. Alles in allem sollte das Konzept der Pflanzen für die Gemeine Fichte die genotypische Variation gegen Krankheitserreger erweitern, und das inhärente Mykobiom sollte als Faktoren betrachtet werden, die in Resistenzstudien einbezogen werden sollten.
 
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