Einfluss von GnRH-Analoga auf Proliferation und Invasion von GnRH-Rezeptor-positiven Zervixkarzinomzellen

Influence of GnRH analogs on proliferation and invasion of GnRH receptor-positive cervical carcinoma cells

by Bastienne-Célestine Eder
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-11-19
Date of issue:2024-11-06
Advisor:Prof. Dr. Carsten Gründker
Referee:Prof. Dr. Carsten Gründker
Referee:Prof. Dr. Dieter Kube
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10833

 

 

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Abstract

English

Despite a significant decline in the incidence of cervical cancer in Germany due to the intensification of preventive measures, the five-year overall survival rate for cervical cancer remains at 65%. Conversely, cervical cancer ranks as the fourth most common cancer among women worldwide. To improve prognosis and expand therapeutic options, this work is based on research findings related to the treatment of GnRH receptor-positive cancer cells in gynecological tumors using GnRH analogs. Preliminary results from the research group have shown promising outcomes, demonstrating a reduction in both proliferation and invasion in response to GnRH analog treatment. To investigate the expression of GnRH receptors in the HT-3 and C33-A cell lines, an immunofluorescence staining was performed using a GnRH antibody. The expression of the GnRH receptor was successfully confirmed. Additionally, the expression of GnRH receptors across various histopathological subtypes of cervical cancer was assessed using a tissue microarray. Increased GnRH receptor expression was observed with progressive loss of cell differentiation. To analyze the proliferative behavior of the cells, a viability assay utilizing alamarBlue® was conducted. A trend towards reduced proliferation of the C33-A cell line was noted following treatment with the GnRH agonist Triptorelin, along with a significant reduction in proliferation under treatment with the GnRH antagonist Cetrorelix. However, due to the lack of consistent statistical significance and high standard deviations, these results could only be interpreted with caution. Indications emerged suggesting a potential negation of the dichotomy between GnRH agonists and antagonists. Invasion behavior was analyzed through a 2D coculture invasion assay and a 3D invasion assay. The 2D coculture invasion assay indicated a trend towards reduced invasion of the HT-3 cell line when treated with Triptorelin at a concentration of 10^-7 M, alongside a significant reduction in invasion under treatment with Cetrorelix at the same concentration. However, the 3D invasion assay failed to reproduce these results, which was attributed to challenging experimental and evaluation conditions. The research group previously demonstrated a reduction in the expression of prometastatic factors CYR61 and S100A4 in the treatment of mammary carcinoma cells. To further understand these findings, visual immunofluorescent staining of 3D spheroids for CYR61, S100A4, as well as RhoA and c-myc was conducted. This experimental series was performed for the first time within the group and suggested that the analysis could provide insights into expression patterns and intensities. In addition to the immunofluorescence staining of the spheroids, an evaluation of CYR61 expression was performed using a tissue microarray, along with quantification through Western blot analysis. A significant expression of CYR61 was observed in malignant tissue compared to benign cervical lesions. Conversely, no decreased expression was noted under treatment with CYR61 in the statistical evaluation of the Western blot. Further studies are warranted to elucidate the effects of GnRH analogs on cervical cancer, to deepen the understanding of the role of CYR61, as well as other oncogenic factors, and to develop additional therapeutic options for the treatment of cervical cancer.
Keywords: GnRH analogs; Triptorelin; Cetrorelix; HT-3; C33-A; GnRH receptors; cervical cancer; proliferation; invasion

German

Trotz des deutlichen Rückganges der Inzidenz des Zervixkarzinoms in Deutschland durch die Intensivierung von Präventionsmaßnahmen liegt das 5-Jahres-Gesamtüberleben des Zervixkarzinoms weiterhin bei 65%. Weltweit hingegen nimmt das Zervixkarzinom die vierte Stelle der Krebserkrankungen bei Frauen ein. Zur Verbesserung der Prognose sowie zur Erweiterung der Therapieoptionen stützt sich die Arbeit auf die Grundlage der Forschungsergebnisse der Behandlung von GnRH-Rezeptor- positiven Krebszellen gynäkologischer Tumore mit GnRH-Analoga. Ergebnisse der Arbeitsgruppe zeigten bereits vielversprechende Resultate und konnten eine Reduktion der Proliferation sowie der Invasion unter der Behandlung mit GnRH-Analoga erreichen. Zur Untersuchung der GnRH-Rezeptor-Expression der Zelllinien HT-3 und C33-A wurde eine Immunfluoreszenzfärbung mit einem GnRH-Antikörper durchgeführt. Es konnte die Expression des GnRH-Rezeptors nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde mittels eines tissue microarrays die GnRH-Rezeptor-Expression verschiedener histopathologischer Subtypen des Zervixkarzinoms nachgewiesen. Es zeigte sich eine erhöhte GnRH-Rezeptor- Expression mit dem zunehmenden Verlust der Zelldifferenzierung. Zur Analyse des Proliferationsverhaltens der Zellen wurde ein Viabilitätsassay mit alamarBlue® durchgeführt. Es zeigte sich eine tendenzielle Reduktion der Proliferation der Zelllinie C33-A unter der Behandlung mit dem GnRH-Agonisten Triptorelin sowie eine signifikante Reduktion der Proliferation unter der Behandlung mit dem GnRH-Antagonisten Cetrorelix. Diese Ergebnisse ließen sich aufgrund fehlender konsequenter statistischer Signifikanzen sowie hohen Standartabweichungen nur eingeschränkt verwerten. Es ergaben sich Hinweise auf eine Aufhebung der Dichotomie des GnRH-Agonisten und des GnRH- Antagonisten. Zur Analyse des Invasionsverhaltens wurde ein 2D-Kokultur-Invasionsassay sowie ein 3D- Invasionsassay durchgeführt. Es konnte im 2D-Kokultur-Invasionsassay eine tendenzielle Reduktion der Invasion der Zelllinie HT-3 unter der Behandlung von Triptorelin 10-7 M sowie eine signifikante Reduktion der Invasion unter der Behandlung von Cetrorelix 10-7 M gezeigt werden. Die Durchführung des 3D-Invasionsassay konnte keine Reduktion der Invasion reproduzieren, was mit erschwerten Versuchs- sowie Auswertungsbedingungen erklärt wurde. Die Arbeitsgruppe konnte im Vorfeld der Arbeit bei der Behandlung von Mammakarzinomzellen eine Reduktion der Expression von den prometastasierenden Faktoren CYR61 sowie S100A4 zeigen. Zum weiteren Verständnis und auf der Grundlage dieser Ergebnisse der Arbeitsgruppe wurde eine visuelle immunfluoreszierende Färbung von 3D-Sphäroiden von CYR61, S100A4 sowie zusätzlich RhoA und c-myc durchgeführt. Die Versuchsreihe wurde im Zuge der Arbeit erstmals innerhalb der Arbeitsgruppe durchgeführt und gab einen Hinweis darauf, dass der Versuch zur Analyse eines Expressionsmusters sowie der Expressionsintensität genutzt werden kann. Es erfolgte neben der Immunfluoreszenzfärbung des Sphäroides außerdem eine Auswertung der CYR61-Expression in Form eines tissue microarrays sowie die Quantifizierung der CYR61- Expression anhand eines Western Blots. Es konnte eine signifikante Expression von CYR61 in malignem Gewebe im Vergleich zu benignen Zervixstanzen beobachtet werden. Gleichzeitig zeigte sich unter der Behandlung von CYR61 im Western Blot keine verminderte Expression in der statistischen Wertung. Es sind ferner weitere Studien an diese Untersuchungen anzuschließen, um den Einfluss der GnRH-Analoga auf das Zervixkarzinom fortführend zu erläutern, das Verständnis der Rolle von CYR61 sowie der weiteren onkogenen Faktoren zu vertiefen und eine zusätzliche Therapiemöglichkeit für die Behandlung des Zervixkarzinoms zu schaffen.