Morphologische Studien zu Veränderungen der Vaskularisation der Cochlea bei verschiedenen Formen der Schallempfindungsschwerhörigkeit

Morphological studies on changes in the vascularisation of the cochlea in different forms of sensorineural hearing loss

by Tilman Clemens Horn
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-12-05
Date of issue:2024-11-19
Advisor:Prof. Dr. Nicola Strenzke
Referee:Prof. Dr. Nicola Strenzke
Referee:Prof. Dr. Nicolas Feltgen
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10876

 

 

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Abstract

English

The objective of this work was the further development and implementation of methods for the qualitative and quantitative investigation of the fine-vascular structures of the lateral wall of the murine cochlea in presbycusis and genetic hearing defects. The preparation and processing of these fragile structures proved to be very challenging. Immunohistochemically, Griffonia simplicifolia Isolectin B4 (GS-IB4) for the endothelial cells has been shown to be suitable for staining for confocal-microscopic observation of membrane preparations, an antibody against chondroitin-sulfate proteoglycan NG2 for the pericytes, and an antibody against EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1 (F4/80) for the perivascular-resident macrophages of the melanocyte type (PVM/Ms). For the lightsheet method, obtaining autofluorescence with glutaraldehyde proved to be effective and time-saving compared to established iDISCO (immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs) protocols. With increasing age of the mice, both the stria vascularis and the ligamentum spirale showed a decreasing vascular density. The endothelium appeared more fragile and less stained. The PVM/Ms changed in morphology and decreased in number. The density of the pericytes also decreased with age. Otoferlin is a hair-cell-specific protein that is essential for the synaptic function of the inner hair cells and thereby for hearing. A comparison between the deaf Otof-knockout line and the corresponding wild-type models showed a pattern contrary to the presbycusis model in the stria vascularis: Otof mutants had a higher vascular density, although these vessels tended to be smaller in diameter. The vessel diameter also tended to be narrower in the ligamentum spirale of Otof mutants. The vessels of the Otof-knockout mice appeared “fragile,” and their pathways were unsorted and disorganized. With regard to the smaller vessel diameter, it is conceivable that due to the synaptic deficit, the demand for energy and consequently arterial oxygen and blood is lower, and therefore less blood flow is required. Overall, the stria vascularis shows surprisingly little change in the genetic alterations analyzed compared to the presbycusis model. Despite the functional deficit and the secondary age-related loss of hair cells and neuronal structures, the stria vascularis in Otof-knockout mice shows relatively little damage. This knowledge is important for the development of novel gene therapeutics for DFNB9 deafness caused by OTOF mutations. Based on our data, it can be assumed that the structure of the stria vascularis is preserved. If the expression of Otoferlin and thus the function of the inner hair cells is restored, no impairment of hearing function due to additional disturbances of cochlear homeostasis should be expected.
Keywords: cochlea; loss; genetic; hearing loss; stria vascularis; presbyakusis; mice; otof; otoferlin; cochlea; vessels

German

Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung und Anwendung von Methoden zur qualitativen und quantitativen Untersuchung der feinen Gefäßstrukturen der lateralen Wand der murinen Cochlea bei Presbyakusis und genetisch-bedingten Hördefekten. Die Präparation und Aufarbeitung dieser delikaten Strukturen erwies sich als sehr herausfordernd. Immunhistochemisch bewährten sich für die Anfärbung zur konfokal-mikroskopischen Betrachtung von Häutchenpräparaten Griffonia simplicifolia Isolectin B4 (GS-IB4) für die Endothelzellen, ein Antikörper gegen Chondroitinsulfat-Proteoglycan NG2 für die Perizyten und ein Antikörper gegen EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1 (F4/80) für die perivaskulär residenten Makrophagen vom Melanozytentyp (PVM/Ms). Für das Lightsheet-Verfahren erwies sich der Erhalt der Autofluoreszenz mit Glutaraldehyd als effektiv und zeitsparend gegenüber etablierten iDISCO-Protokollen (Immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs). Mit zunehmendem Lebensalter der Mäuse zeigte sich sowohl in der Stria vascularis als auch im Ligamentum spirale eine abnehmende Gefäßdichte. Das Endothel erschien „brüchiger“ und schwächer angefärbt. Die PVM/Ms veränderten sich in Morphologie nahmen an Zahl ab. Auch die Dichte der Perizyten nahm im Altersverlauf ab. Otoferlin ist ein haarzellspezifisches Protein, welches für die synaptische Funktion der inneren Haarsinneszellen und damit für das Hören essenziell ist. Im Vergleich der tauben Otof-Knockout-Linie mit den entsprechenden Wildtyp-Vergleichen zeigte sich in der Stria vascularis ein gegensätzliches Bild zum Modell der Presbyakusis: Bei Otof-Mutanten zeigte sich eine höhere Gefäßdichte, wobei diese Gefäße tendenziell von kleinerem Durchmesser waren. Auch im Ligamentum spirale von Otof-Mutanten war der Gefäßdurchmesser tendenziell schmaler. Die Gefäße der Otof-Knockout-Mäuse wirkten „brüchig“ und ihre Verläufe unsortiert und desorganisiert. Hinsichtlich des geringeren Gefäßdurchmessers ist vorstellbar, dass aufgrund des Synapsendefizits der Energie- und damit der arterielle Sauerstoff- und Blutbedarf geringer ausfällt und daher weniger Blutfluss benötigt wird. Insgesamt zeigt sich die Stria vascularis bei den untersuchten genetischen Veränderungen im Vergleich zum Modell der Presbyakusis erstaunlich wenig verändert. Trotz des Funktionsdefizits und dem sekundären altersabhängigen Verlust an Haarzellen und neuronalen Strukturen weist die Stria vascularis bei Otof-Knockout-Mäusen also eine verhältnismäßige geringe Schädigung auf. Diese Information ist wichtig für die Entwicklung neuartiger Gentherapie der durch OTOF-Mutationen bedingten Taubheit DFNB9. Anhand unserer Daten kann von einer intakten Struktur der Stria vascularis ausgegangen werden. Bei Wiederherstellung der Otoferlin-Expression und damit Funktion der inneren Haarzellen ist demnach eher keine Beeinträchtigung der Hörfunktion durch zusätzliche Störungen der cochleären Homöostase zu erwarten.
Schlagwörter: genetisch; Taubheit; Schwerhörigkeit; Stria vascularis; Altersschwerhörigkeit; Otof; Otoferlin; Cochlea; Gefäße