FOXO3 in myogener Differenzierung vor dem Hintergrund von Sarkopenie und Kachexie
FOXO3 in myogenic differentiation in context of sarcopenia and cachexia
by Marlene Gsänger
Date of Examination:2024-11-20
Date of issue:2024-11-19
Advisor:Prof. Dr Arndt Schilling
Referee:Prof. Dr Arndt Schilling
Referee:Prof. Dr. Heide Siggelkow
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10877
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Abstract
English
Sarcopenia and cachexia are medical conditions that are characterized to different extent by a loss in muscle strength and muscle mass and cause a serious negative impact on patient`s health and quality of life. Until now there is no effective treatment for these two muscle wasting conditions available. The transcription factor FOXO3 has a key role in both their pathogenesis and therefore is an interesting target structure for future therapeutic drugs. This thesis examines siRNA-mediated knockdown of FOXO3 in C2C12 mouse myoblasts as a model. The first experiments served to define optimal conditions for differentiation and transfection with siRNA. Results on optimal starting cell count, serum components for proliferation and differentiation and transfection protocol were used in the following main experiment. In the main experiment C2C12 cells were transfected with siRNA against Foxo3 via lipofection and then differentiated for eight days, while being photographed daily under a light microscope. Then qPCR was performed for Foxo3, its downstream target Atrogin-1 and differentiation markers Myog and MyH4. After 48 h the transfection showed a knockdown of Foxo3 by 29 % compared to transfection with siRNA against Luciferase. The effect was significant and was shown for two days. Transfected cells also showed a reduced expression of Atrogin-1 48 h after transfection. There was no optical difference for differentiation for knockdown cells and control. An increase in Foxo3-expression in both groups during differentiation as well as a reduced increase of differentiation markers Myog and MyH4 in the knockdown cells suggest an enhancing role for FOXO3 in myogenic differentiation. To test the effect of Foxo3 knockdown on C2C12 proliferation, confluence after transfection with siRNA against Foxo3 or Luciferase was measured by cytometry. Knockdown cells showed a reduced proliferation rate compared to the control cells. As a control of quality the main experiment was repeated with control-transfected and non-transfected cells to exclude an influence of the used transfection reagent Lipofectamine® 2000 on Foxo3 expression. No difference in Foxo3 expression was shown between the two groups. In conlusion, the results of this thesis show that a knockdown of FOXO3 is possible using siRNA in a cell culture model and has an impact on cellular functions controlled or influenced by FOXO3. Knockdown could be a way to deactivate FOXO3 and possibly counteract atrophy in sarcopenia and cachexia.
Keywords: sarcopenia; cachexia; FOXO3; myogenic differentiation
German
Sarkopenie und Kachexie sind medizinische Phänomene, die in unterschiedlicher Gewichtung mit dem Verlust von Muskelkraft und -masse einhergehen und schwerwiegende Beeinträchtigungen von Gesundheit und Lebensqualität verursachen. Eine Schlüsselrolle in ihrer Pathogenese spielt der Transkriptionsfaktor FOXO3. Er stellt daher eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung zukünftiger Medikamente dar, denn bisher existiert keine wirksame Therapie für diese beiden muscle wasting Erkrankungen. In der vorliegenden Arbeit wurde modellhaft in C2C12-Mausmyoblasten die Ausschaltung von FOXO3 mittels siRNA untersucht. In verschiedenen Versuchen wurden dabei mehrere Fragestellungen bearbeitet. Zunächst wurden im Sinne einer Methoden-Etablierung unterschiedliche Medien zur Differenzierung der Myoblasten zu Myotuben sowie verschiedene Protokolle zur Transfektion der Zellen miteinander verglichen. Das Differenzierungsmedium mit dem geringsten Serum- und Wachstumsfaktorgehalt zeigte die besten Differenzierungsergebnisse und wurde den Hauptversuchen zugrunde gelegt. Anhand der Transfektionsversuche mit pmaxGFP-Markierung wurden Inkubationszeiten und Ausgangs-Zellzahl für das Transfektionsprotokoll der Hauptversuche festgelegt. Da sich in diesen Vorversuchen nur undifferenzierte Myoblasten nachweisbar mittels Lipofektion transfizieren ließen, wurde in den Hauptversuchen die Transfektion vor Beginn der Differenzierung durchgeführt. Um die Möglichkeit eines knockdown von Foxo3 in C2C12-Zellen und seine Auswirkungen zu untersuchen, wurden die Zellen mit siRNA gegen Foxo3 transfiziert, acht Tage lang differenziert, unter dem Lichtmikroskop fotografiert und qPCR für Foxo3, sein downstream target Atrogin-1 sowie für die Differenzierungsmarker Myog und MyH4 durchgeführt. Das Einbringen entsprechender siRNA führte 48 h nach Transfektion zu einem knockdown von Foxo3 um knapp 30 % im Vergleich zur Transfektion mit siRNA gegen Luciferase. Der signifikante Effekt hielt zwei Tage lang an. Zudem zeigten die transfizierten Zellen eine reduzierte Expression von Atrogin-1 ebenfalls 48 h nach Transfektion. Für die Differenzierung zeigten sich optisch keine Unterschiede zwischen knockdown-Zellen und kontroll-transfizierten Zellen. Ein nachweisbarer Anstieg der Foxo3-Expression in beiden Gruppen, sowie ein geringerer Anstieg der Differenzierungsmarker Myog und MyH4 in der knockdown-Gruppe sprechen jedoch für eine positive Rolle von FOXO3 in der myogenen Differenzierung und für eine Beeinträchtigung derselben durch die Ausschaltung von FOXO3 in noch undifferenzierten Muskelvorläufern. Diese Interpretation lässt sich anhand aktueller Literatur stützen. Um den Effekt des Foxo3 knockdowns auf die Proliferationsfähigkeit von C2C12-Zellen zu überprüfen, wurde die Konfluenzentwicklung von C2C12 nach Transfektion mit siRNA gegen Foxo3 oder gegen Luciferase im Celigo® Zyotmeter gemessen. Die knockdown Zellen zeigten dabei eine deutlich langsamere Zunahme der Konfluenz, entsprechend einer geringeren Proliferationsrate im Vergleich zu den Kontrollzellen. Als ergänzende Qualitätskontrolle der verwendeten Methodik sollte ein Einfluss des Transfektionsreagenz Lipofectamine® 2000 auf die Expression von Foxo3 ausgeschlossen werden. Hierfür wurde der Genexpressionsversuch wiederholt, jedoch mit kontroll-transfizierten Zellen und Zellen, die überhaupt nicht transfiziert wurden. Hier ließ sich kein Unterschied in der Foxo3-Expression zwischen transfizierten und nicht-transfizierten Zellen nachweisen. Dieses Ergebnis stützt die Ergebnisse aus Genexpressionsversuch und Proliferationsassay. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass ein knockdown von Foxo3 mittels siRNA im Zellkultur-Modell möglich ist und auch Auswirkungen auf zelluläre Funktionen hat, welche von FOXO3 beeinflusst werden. Der knockdown stellt also eine Herangehensweise dar, um FOXO3 auszuschalten und somit möglicherweise auch der Atrophie im Rahmen von Sarkopenie und Kachexie entgegenzuwirken.
Schlagwörter: Sarkopenie; Kachexie; FOXO3; Myogene Differenzierung
