Rate-limiting steps of autophagy initiation

by Anoshi Patel
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-08-13
Date of issue:2024-12-23
Advisor:Dr. Alex Caspar Faesen
Referee:Prof. Dr. Hauke Hillen
Referee:Dr. Marieke Oudelaar
Referee:Prof. Dr. Kai Tittmann
Referee:Dr. Oleksiy Kovtun
Referee:Dr. Ricarda Richter-Dennerlein
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10867

 

 

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Abstract

English

Autophagy research has progressed tremendously since the identification of ‘ATG’ genes and proteins responsible for maintaining the process. A dissection of general functions of all proteins involved was possible. However, the regulation of human autophagy, particularly autophagy initiation remains unclear. Autophagosome biogenesis involves a coordinated assembly of many proteins organized in subcomplexes, at an initiation site between the endoplasmic reticulum (ER) and a newly forming Isolation Membrane (IM). How the assembly is regulated and coordinated molecularly is poorly understood. Our previous work using in vitro reconstitution purifying full-length human autophagy initiation proteins on a large scale was the first to show a spontaneous super-complex assembly of autophagy initiation proteins. With this, a need to regulate spontaneous assembly in an on-demand manner was identified. Only a core complex of ATG9-13-101 enabled super-complex assembly. A closer look within this complex identified a rare, emerging concept of protein metamorphosis that governed interactions of ATG13 and ATG101 to ATG9. It led to a hypothesis that the kinetic bottleneck responsible for inhibiting or upregulating super-complex assembly on-demand could be within these interactions. ATG13 and ATG101 are metamorphic proteins of the HORMA domain family. Metamorphic proteins have evolved to exhibit two conformers with entirely different structural folds of the same protein Switching between the default fold and the second, triggered fold is often rate-limiting, because the switch can happen spontaneously at a very slow rate. This thesis aims to isolate the rate-limiting step of ATG9-13-101 complex assembly. For this, a kinetic assay based on fluorescence polarization was developed and interactions quantified. An unexpected rate-limiting interaction was identified in the association of the two metamorphic proteins ATG13 and ATG101. A detailed characterization of ATG101 mutants in order to identify alternate conformers led to investigation of ATG101 homodimerization. Eventually, a model of accelerating the obligatory, rate-limiting ATG13-ATG101 association is discussed. Finally, pathways which harbour metamorphic proteins often involve active catalysis because of the slow fold conversions. Work in this thesis, providing a detailed characterization of all interactions within this complex, provides a strong platform for future goals aiming to identify catalysts of autophagy initiation.
Keywords: Protein metamorphosis; Protein-protein interactions; Kinetics; Structural dynamics

German

Die Autophagieforschung hat seit der Identifizierung der für die Aufrechterhaltung des Prozesses verantwortlichen „ATG“-Gene und -Proteine ​​enorme Fortschritte gemacht. Eine Analyse der allgemeinen Funktionen aller beteiligten Proteine ​​war möglich. Die Regulierung der menschlichen Autophagie, insbesondere der Autophagie-Initiierung, bleibt jedoch unklar. Die Biogenese von Autophagosomen umfasst eine koordinierte Ansammlung vieler Proteine, die in Unterkomplexen organisiert sind, an einer Initiierungsstelle zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und einer neu entstehenden Isolationsmembran (IM). Wie die Ansammlung molekular reguliert und koordiniert wird, ist noch nicht vollständig verstanden. Unsere vorherige Arbeit mit In-vitro-Rekonstitution und Reinigung vollständiger menschlicher Autophagie-Initiationsproteine ​​in großem Maßstab war die erste, die eine spontane superkomplexe Ansammlung von Autophagie-Initiationsproteinen zeigte. Damit wurde die Notwendigkeit erkannt, die spontane Ansammlung nach Bedarf zu regulieren. Nur ein Kernkomplex von ATG9-13-101 ermöglichte die superkomplexe Ansammlung. Bei genauerer Betrachtung dieses Komplexes wurde ein seltenes, aufkommendes Konzept der Proteinmetamorphose identifiziert, das die Interaktionen von ATG13 und ATG101 mit ATG9 steuert. Dies führte zu der Hypothese, dass der kinetische Flaschenhals, der für die Hemmung oder Hochregulierung der Superkomplex-Assemblierung nach Bedarf verantwortlich ist, in diesen Interaktionen liegen könnte. ATG13 und ATG101 sind metamorphe Proteine ​​der HORMA-Domänenfamilie. Metamorphe Proteine ​​haben sich so entwickelt, dass sie zwei Konformere mit völlig unterschiedlichen Strukturfaltungen desselben Proteins aufweisen. Der Wechsel zwischen der Standardfaltung und der zweiten, ausgelösten Faltung ist oft geschwindigkeitsbegrenzend, da der Wechsel spontan und sehr langsam erfolgen kann. Ziel dieser Arbeit ist es, den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt der ATG9-13-101-Komplex-Assemblierung zu isolieren. Zu diesem Zweck wurde ein kinetischer Test auf Basis der Fluoreszenzpolarisation entwickelt und Interaktionen quantifiziert. Bei der Assoziation der beiden metamorphen Proteine ​​ATG13 und ATG101 wurde eine unerwartete geschwindigkeitsbegrenzende Interaktion identifiziert. Eine detaillierte Charakterisierung von ATG101-Mutanten zur Identifizierung alternativer Konformere führte zur Untersuchung der ATG101-Homodimerisierung. Schließlich wird ein Modell zur Beschleunigung der obligatorischen, geschwindigkeitsbegrenzenden ATG13-ATG101-Assoziation diskutiert. Schließlich beinhalten Stoffwechselwege, die metamorphe Proteine ​​enthalten, aufgrund der langsamen Faltungsumwandlungen häufig eine aktive Katalyse. Die Arbeit in dieser Dissertation, die eine detaillierte Charakterisierung aller Wechselwirkungen innerhalb dieses Komplexes liefert, bietet eine solide Grundlage für zukünftige Ziele zur Identifizierung von Katalysatoren der Autophagie-Initiierung.