Molecular assembly of auditory ribbon synapses in mice

by Dinah Burfeind
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-01-21
Date of issue:2025-01-17
Advisor:Prof. Dr. Tina, Pangršič
Referee:Prof. Dr. Tina Pangršič
Referee:Prof. Dr. Silvio Rizzoli
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11007

 

 

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Abstract

English

Auditory ribbon synapses are specialized structures in the inner hair cells (IHCs) that enable rapid neurotransmitter release, making them essential for precise signal transmission in the auditory system. However, insights into the developmental formation and maturation of these specialized synapses are still lacking. Investigating their composition provides crucial insights into their role in auditory development. This methodological doctoral thesis explores three approaches to studying the assembly of auditory ribbon structures. First, we analyzed the distribution patterns of mRNA of relevant proteins at the mRNA level using RNAscope. In this process, we modified the protocol so that, on one hand, we could outline cell bodies using immunohistochemistry, and on the other hand, examine whole cells through "floating samples." Next, we attempted to detect the in vivo translation of ribbon proteins using a puromycin-based Proximity Ligation Assay (PLA). While we successfully optimized puromycin uptake into the cells, the specificity of the PLA proved insufficient, limiting the applicability of this method in this context. Finally, we used isotopically labeled amino acids and NanoSIMS imaging to identify uptake in ribbon-associated regions. Here, we were able to show signs of increased uptake, which might indicate enhanced protein turnover during ribbon maturation. While RNAscope and NanoSIMS appeared as promising tools for studying ribbon formation, further validation with larger sample sizes is necessary to support these results. Ultimately, this research enhances our understanding of the molecular mechanisms driving ribbon synapse development and thereby providing valuable insights into auditory processing.
Keywords: NanoSIMS; Ribbon synapses; protein turnover; RNAscope; puromycin-based Proximity Ligation Assay (PLA)

German

Auditorische Bändersynapsen sind spezialisierte Strukturen in den inneren Haarzellen (IHCs), die eine schnelle Neurotransmitterfreisetzung ermöglichen und somit für eine präzise Signalübertragung im auditorischen System essentiell sind. Derzeit fehlen jedoch Einblicke in die entwicklungsbedingte Bildung und Reifung dieser spezialisierten Synapsen. Diese methodische Doktorarbeit untersucht daher drei Ansätze zur Erforschung der Assemblierung auditorischer Ribbon-Strukturen: Zunächst analysierten wir die Verteilungsmuster der mRNA relevanter Proteine mittels RNAscope. Dabei modifizierten wir das Protokoll, sodass wir einerseits die Zellkörper mithilfe von Immunhistochemie abgrenzen und andererseits ganze Zellen durch „floating samples“ betrachten konnten. Anschließend versuchten wir, die subzelluläre Lokalisation der Translation von Ribbon-Proteinen mit einem Puromycin-basierten Proximity Ligation Assay (PLA) nachzuweisen. Obwohl wir die Aufnahme von Puromycin in die Zellen erfolgreich etablieren und optimieren konnten, erwies sich die Spezifität des PLAs im intakten Gewebe als unzureichend, was die Anwendbarkeit dieser Methode in diesem Kontext einschränkte. Schließlich verwendeten wir isotopisch markierte Aminosäuren und nanoscale secondary ion mass spectrometry („NanoSIMS“), um deren Aufnahme in die synaptischen Bänder zu untersuchen. Hier konnten wir Anzeichen einer erhöhten Aufnahme zeigen, was auf einen gesteigerten Proteinumsatz während der Entstehung der Ribbons hindeuten könnte. Wenn gleich RNAscope und NanoSIMS sich als vielversprechende Werkzeuge zur Untersuchung der Reifung von auditorischen Bändersynapsen darstellten, sind weitere Untersuchung mit größeren Stichprobengrößen notwendig, um diese Ergebnisse zu untermauern. Letztlich bildet diese Arbeit die Basis zur Erweiterung unseres Verständnisses der molekularen Mechanismen, die die Entwicklung der Ribbon-Synapsen steuern, und ebnet den Weg für fundamental neue, wertvolle Einblicke in die auditorische Verarbeitung.
 
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