Chondrogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen: Der Einfluss von Hyaluronan und Kollagen-Typ-II auf die Chondrogenese in PEGDA-Hydrogelen
Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells: The influence of hyaluronan and collagen type II on chondrogenesis in PEGDA hydrogels
by Joachim Hermann Wagner
Date of Examination:2025-02-26
Date of issue:2025-02-05
Advisor:Prof. Dr Arndt F. Schilling
Referee:Prof. Dr Arndt F. Schilling
Referee:Prof. Dr. Frauke Alves
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11046
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Abstract
English
The treatment of cartilage defects is challenging since cartilage, as a bradytrophic and avascular tissue, lacks the necessary self-regeneration capacity to adequately repair degenerative, inflammatory or traumatic defects. Tissue engineering presents a new possibility for repairing, replacing or supporting hyaline cartilage with the aid of artificial tissues. The chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) offers the possibility to create the cellular basis of such artificial tissues from the precursor cells of cartilage tissue. In this context, chondrogenesis can be initiated by physical or biochemical differentiation stimuli and the development of stem cells can be directed with the help of such differentiation cues. Soluble biochemical factors such as hormones, but also physical factors such as low oxygen partial pressure are known stimuli that influence chondrogenic differentiation. The influence of the extracellular matrix (ECM) on differentiation is only known in its basic principles, which is why further research is needed to understand the interaction of mesenchymal stem cells with their environment. In order to study these interactions in a physiological environment, 3D cell cultures are necessary. The aim of this thesis was to investigate the influence of hyaluronan and collagen type II as the most common ECM components on the chondrogenic differentiation of human MSCs. For this purpose, MSCs were cultivated in three-dimensional PEGDA hydrogels. Furthermore, stem cells were isolated from the bone marrow of patients operated at the University Medical Center Göttingen and established as cell lines. A total of three human bone marrow mesenchymal stem cell lines (hBM MSCs) were obtained and their MSC-typical surface markers were detected by flow cytometry. The multipotent differentiation potential into an adipogenic, a chondrogenic and an osteogenic genotype was confirmed on one hBM MSC line and, at the same time, self-mixed adipogenic and chondrogenic differentiation media were established. In addition, hypoxia proved to be an effective trigger of chondrogenesis in 3D spheroid cultures, which further enhanced the effect of the differentiation medium. The most effective procedure for the challenging isolation of nucleic acids from spheroid and PEGDA cultures was determined from numerous isolation methods and subsequently applied. A protocol for the preparation of PEGDA frozen sections for histological processing was also developed. To investigate the influence of hyaluronan and collagen type II on chondrogenic differentiation, three different PEGDA hydrogels were prepared: a pure hydrogel (P PEGDA), a hydrogel containing hyaluronan (H PEGDA) and a hydrogel containing collagen type II (K II PEGDA hydrogel). Physical analyses showed that the pure P PEGDA hydrogels had a higher swelling ratio than the H and K II PEGDA hydrogels and that the Young's modulus of the H PEGDA samples was significantly higher than the one of the other hydrogel types. Cell viability in PEGDA cultures was shown by live dead staining over a period of 21 days, with PEGDA 6000 proving to be the most suitable hydrogel. The analysis of gene expression showed that the H PEGDA cultures exhibited the strongest chondrogenic gene expression after 14 days of differentiation, regardless of the cell culture medium. Equal levels of expression were observed in the P and K II PEGDA cultures, both of which were significantly higher than in the control group. Histology revealed no significant production of extracellular matrix typical for cartilage tissue, whereas immunohistochemistry confirmed the presence of aggrecan and chondroitin sulfate. This was most clearly seen in the H PEGDA culture. Overall, this project was able to prove the strong chondrogenic effect of hyaluronan on MSCs. Furthermore, it illustrated that culture conditions typical for cartilage, such as hypoxia and cartilage-typical cell densities, can initiate the chondrogenesis of MSCs even without further external influences. The question of the still quite ambiguous role of collagen type II in the differentiation process remains unanswered, which emphasizes that chondrogenesis is a complex interaction of numerous factors. In order to find better constructs for the replacement of cartilage, research is currently being conducted on numerous hydrogels and other artificial tissues, which differ greatly in their basic structure, microarchitecture and exact composition. The decoding of matrix-cell interaction in the context of tissue differentiation is therefore continuing, as is the search for an ideal artificial tissue for the treatment of cartilage defects.
Keywords: chondrogenesis; chondrogenic differentiation; tissue engineering; artificial tissue; cartilage; cartilage injury; cartilage defects; mesenchymal stem cells; hyaluronan; hyaluronic acid; collagen type II; PEGDA; polyethylene glycol diacrylate; immunohistochemistry; cell culture; 3d cell culture; collagen
German
Die Therapie von Knorpeldefekten ist herausfordernd, da Knorpel als bradytrophem und avaskulärem Gewebe die nötige Selbstregenerationskapazität fehlt, um degenerative, entzündliche oder traumatische Defekte adäquat reparieren zu können. Tissue Engineering stellt eine neue Möglichkeit dar, hyalinen Knorpel mithilfe von Ersatzgeweben reparieren, ersetzen oder unterstützen zu können. Die chondrogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen (MSCs) bietet die Möglichkeit, aus den Vorläuferzellen von Knorpelgewebe die zelluläre Grundlage solcher Ersatzgewebe zu schaffen. In diesem Kontext kann die Chondrogenese durch physikalische oder biologisch-chemische Differenzierungsreize initiiert und die Entwicklung von Stammzellen mithilfe solcher Differenzierungstrigger gezielt gelenkt werden. Lösliche Komponenten biologisch-chemischer Einflussfaktoren wie Hormone, aber auch physikalische Faktoren wie ein geringer Sauerstoffpartialdruck sind bekannte Stimuli, die die chondrogene Differenzierung beeinflussen. Die Einflüsse der Extrazellulären Matrix (EZM) auf die Differenzierung sind bisher nur in den Grundzügen bekannt, weshalb es weitere Forschung benötigt, um die Interaktion mesenchymaler Stammzellen mit ihrer Umgebung zu verstehen. Um diese Interaktionen im physiologischen Umfeld untersuchen zu können, sind 3D-Zellkulturen notwendig. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von Hyaluronan und Kollagen-Typ-II als häufigste EZM-Bestandteile auf die chondrogene Differenzierung humaner MSCs zu untersuchen. Hierzu erfolgte die Kultivierung in dreidimensionalen PEGDA-Hydrogel-Kulturen. Des Weiteren sollten Stammzellen aus dem Knochenmark von Patient*innen der Universitätsmedizin Göttingen isoliert und als Zelllinien etabliert werden. Insgesamt konnten drei humane Stammzelllinien (hBM MSCs) gewonnen werden, deren MSC-typische Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen wurden. Das multipotente Differenzierungspotenzial in einen adipogenen, einen chondrogenen und einen osteogenen Genotyp wurde an einer hBM-MSC-Linie bestätigt und im gleichen Zug wurden selbst hergestellte adipogene und chondrogene Differenzierungsmedien etabliert. Darüber hinaus zeigte sich in 3D-Sphäroid-Kulturen Hypoxie als wirksamer Trigger der Chondrogenese, der die Wirkung des Differenzierungsmediums zusätzlich verstärkte. Für die herausfordernde Isolation von Nukleinsäuren aus Sphäroid- und PEGDA-Kulturen wurde aus zahlreichen Isolationsmethoden die wirksamste Vorgehensweise bestimmt und anschließend eingesetzt. Ein Protokoll zur Erstellung von PEGDA-Gefrierschnitten zur histologischen Aufbereitung wurde ebenfalls erarbeitet. Um den Einfluss von Hyaluronan und Kollagen-Typ-II auf die chondrogene Differenzierung zu untersuchen, wurden drei verschiedene PEGDA-Hydrogele erstellt: ein reines Hydrogel (P-PEGDA), ein hyaluronanhaltiges Hydrogel (H-PEGDA) und ein Kollagen-Typ-II-haltiges Hydrogel (K-II-PEGDA-Hydrogel). In physikalischen Analysen zeigte sich, dass die reinen P-PEGDA-Hydrogele einen höheren Quellindex als die H- und K-II-PEGDA-Hydrogele besaßen und dass der Elastizitätsmodul der H-PEGDA-Proben deutlich über dem der anderen Hydrogelarten lag. Das Überleben der Zellen in PEGDA-Kulturen wurde mittels Lebend-Tot-Färbung über 21 Tage nachgewiesen, wobei sich PEGDA-6000 als das geeignetste Hydrogel erwies. Die Analyse der Genexpression ergab, dass die H-PEGDA-Kulturen nach 14-tägiger Differenzierung unabhängig vom Zellkulturmedium die stärkste chondrogene Genexpression aufwiesen. Bei den P- und K-II-PEGDA-Kulturen wurden gleich starke Expressionen beobachtet, die beide signifikant über dem Niveau der Kontrollgruppe lagen. Die Histologie offenbarte keine wesentliche Produktion von knorpeltypischer extrazellulärer Matrix, wohingegen sich in der Immunhistochemie das Vorkommen von Aggrecan und Chondroitinsulfat zeigte. Dieses war am deutlichsten in den H-PEGDA-Kulturen zu sehen. Insgesamt konnte diese Arbeit einerseits die stark chondrogene Wirkung von Hyaluronan auf MSCs beweisen und andererseits verdeutlichen, dass knorpeltypische Kulturbedingungen wie beispielsweise Hypoxie und knorpeltypische Zelldichten die Chondrogenese von MSCs auch ohne weitere Fremdeinflüsse initiieren können. Die Frage nach der bisher nicht eindeutigen Rolle von Kollagen-Typ-II im Differenzierungsprozess bleibt unbeantwortet, was verdeutlicht, dass die Chondrogenese ein komplexes Zusammenspiel zahlreicher Faktoren ist. Um bessere Konstrukte für den Ersatz von Knorpel zu finden, wird derzeit an zahlreichen Hydrogelen und anderen Ersatzgeweben geforscht, die sich in ihrer Grundstruktur, Mikroarchitektur und genauen Zusammensetzung stark unterscheiden. Die Entschlüsselung der Matrix-Zell-Interaktion im Rahmen der Gewebedifferenzierung läuft somit weiter, wie auch die Suche nach einem idealen Ersatzgewebe zur Therapie von Knorpeldefekten.
Schlagwörter: Chondrogenese; chondrogene Differenzierung; Tissue Engineering; Knorpel; Knorpelverletzung; Knorpelschaden; mesenchymale Stammzellen; Hyaluronan; Hyaluronsäure; Kollagen-Typ-II; Kollagen; PEGDA; Polyethylenglykol-Diacrylat; Zellkultur; 3D-Zellkultur; Immunhistochemie
