Die Wirkung von Alizarin, Calcein und dem Oberflächenmarker PKH2 auf das Proliferationsverhalten von Rothirsch-Geweihzellen

Abstract

In einer experimentellen Studie sollte anhand von Zellkulturen die Wirkung von Fluoreszenzfarbstoffen auf das Proliferationsverhalten von Rothirsch-Geweihzel len überprüft werden. Die Untersuchung wurde in zwei Versuchsanordnungen durchgeführt. In der ersten Anordnung wurden über 27 Tage vier Gruppen von Zellen in 6-Well-Platten kultiviert. Die drei Verumgruppen wurden jeweils mit den Fluoreszenzfarbstoffen Calcein, Alizarin-Komplexone und PKH2 als Zusatz zu DME-Medium inkubiert. Eine Kontrollgruppe lief parallel zu jeder Verumgruppe mit. Innerhalb der 27 Tage des Versuch wurden an 12 Tagen die Zellzahl be stimmt, so dass für jede Gruppe 12 Serien als Tripletts kultiviert wurden, so dass insgesamt 144 Wells im ersten Versuch mit Zellkulturen beimpft wurden. Die Zell zahl wurde mit der MTT-Methode bestimmt, wobei die Zellzahl einer genau fest gelegten Exstinktion des MTT-Tests zugeordnet wurde. Dazu kann eine Neu bauer-Zählkammer zum Einsatz. Von jedem Well wurden 3 Extinktionen gemes sen. Aus den 9 Messwerten pro Versuchstag wurden dann der Mittelwert berech net und für die weitere Darstellung in den Grafiken benutzt. Zur Differenzierung der Proliferation wurden auch die Berechnung der mittleren Generationszeit, die Anzahl der Generationen und die kumulative Zellzahl herangezogen. In der zweiten Versuchsanordnung wurde neben der Zellzahlbestimmung die Calceinintensität in den fluoreszierenden Zellen gemessen, um einen Zusam menhang zwischen der Proliferation und der Farbstoffbeladung ableiten zu kön nen. Als wesentliche Ergebnisse konnte festgestellt werden, dass die Farbstoffe einen geringen Einfluss auf die Proliferation der Zellen haben, der mit zunehmender Kultivierungszeit aber immer größer wird. Alle Farbstoffe haben in den ersten 8 bis 10 Tagen keinen Einfluss auf die Proliferation. Gegenüber der Kontrollgruppe zeigt Alizarin die stärkste Hemmung der Proliferation, gefolgt von Calcein und PKH2. Am deutlichsten wird dies durch die kumulativen Zellzahl, der mittleren Generationszeit und der Anzahl der Generationen alle in Abhängigkeit von der Kulturzeit vermittelt. Auch die Normalisierung der zeitabhängigen Zellzahl und ihre Differenzenbildung mit der Kontrollgruppe vermittelt brauchbare Ergebnisse, während der einfache Auftrag der Zellzahl gegen die Kulturzeit sich als unüber sichtlich darstellt. Im zweiten Versuchsansatz wurde lediglich Calcein über 44 Tage weiter unter sucht, da Alizarin-Komplexone nur eine geringe Fluoreszenz und sich PKH2 für den längeren Einsatz unter den vorliegen Versuchsbedingen nicht stabil gegen das Ausbleichen zeigte. Calcein hingegen ließ sich sehr gut detektieren. Das Ma ximum seiner Zellkonzentration konnte zwischen dem 18. und 28. Tag in der Kul tur festgestellt werden. Es wurde jedoch nur von wenigen Zellen aufgenommen, die ab dem 28 Tage zum Ende des Versuchs hin stark in ihrer Zahl abnahmen. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann vermutet werden, dass insbeson dere Alizarin und Calcein, die häufigsten Fluorochrome in Tierversuchen zu Kno chenexploration, keinen wesentlichen Einfluss auf die Zellproliferation haben, da sie zumeist im beschränkten Umfang und nur kurzfristig appliziert werden.