In-ovo-Untersuchungen zum Zellstoffwechsel des Hodgkin-Lymphoms

In-ovo studies on the cellular metabolism of Hodgkin's lymphoma

by Margarete Elisabeth Laage
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-04-16
Date of issue:2025-02-27
Advisor:Prof. Dr. Dieter Kube
Referee:Prof. Dr. Dieter Kube
Referee:Prof. Dr. Jörg Wilting
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11109

 

 

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Format:PDF
Description:Dissertation

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Abstract

English

Excellent survival rates of patients with Hodgkin lymphoma (HL), a malignant neoplasm of the lymphatic system, may be compromised by acute and long-term toxicities, including infertility, cardiovascular damage, and secondary malignancies. Furthermore, there is an urgent need for novel therapeutic strategies for patients who experience relapse following high-dose chemotherapy, with the aim of minimizing adverse effects while maintaining therapeutic efficacy. Upcoming treatment approaches include small molecules that selectively target intracellular proteins. One such target is the enzyme nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), which has been found to be aberrantly active in various tumor entities. In vitro analyses have shown that chemical inhibition of NAMPT can be cytotoxic to HL cells. Consequently, as a rate-limiting enzyme in the nicotinamideadeninedinucleotide (NAD⁺) metabolism, NAMPT is presumed to play a crucial role in HL cells. However, it remains unclear whether inhibiting NAMPT activity can also suppress HL tumor growth in vivo. The present study aimed to establish a preclinical xenograft model to investigate this question. Specifically, an in-ovo xenograft model of the chorio-allantoic membrane (CAM) of fertilized chicken eggs was employed to evaluate the effects of the NAMPT inhibitors FK866 and OT-82 on the development of L428 HL cells. This model has been shown to reflect key aspects of human lymphoma progression. Additionally, a red fluorescent mCherry-expressing cell line was established for future in-ovo metabolic analyses. Cells of the L428 HL cell line were applied to the CAM following a 24-hour pre-treatment with FK866, OT-82, or dimethyl sulfoxide (DMSO) as a control. After 96 hours, the resulting lesions were harvested and characterized histologically and morphologically. In addition to tumor surface area, tumor volume was quantified using micro-computed tomography (micro-CT). Although FK866- and OT-82-treated HL cells were still capable of forming tumors in ovo, the resulting lymphomas were smaller, less vascularized, and exhibited lower cellular density with an increased collagen content. However, tumor cells remained positive for the proliferation marker Ki67. Thus, NAMPT inhibition led to a reduction in tumor size and vascularization but did not achieve a complete therapeutic effect. To facilitate future metabolic analyses in ovo, a cell line expressing the red fluorescent fusion protein mCherry-H2B was established. This newly generated cell line responded similarly to the parental L428 cell line in both in-vitro and in-ovo studies regarding cell viability, NAD⁺ levels, and NAMPT expression after treatment with FK866 and OT-82. This suggests that the established cell lines are suitable for future metabolism-focused investigations. In summary, we successfully developed a xenograft model that enables the study of NAMPT activity and its impact on HL tumor development. Furthermore, we demonstrated that NAMPT inhibition influences lymphoma progression in ovo. This novel preclinical model provides a valuable tool for investigating lymphoma metabolism, including fluorescence lifetime microscopy-based analyses.
Keywords: Hodgkin-Lymphoma; CAM-Assay; NAMPT; NAMPT-Inhibitor

German

Die ausgezeichneten Überlebenschancen von Patienten mit Hodgkin-Lymphom (HL), einer bösartigen Neoplasie des lymphatischen Systems, können durch akute und langfristige Toxizitäten wie Infertilität, kardiovaskuläre Schäden oder sekundäre Malignome beeinträchtigt werden. Darüber hinaus werden dringend neue Therapien für Patient*innen benötigt, die nach einer Hochdosis-Chemotherapie einen Rückfall erleiden, mit dem Ziel, unerwünschte Risiken zu minimieren und gleichzeitig die Wirksamkeit zu erhalten. Zu den aufkommenden Therapieansätzen gehören kleine Moleküle, die intrazelluläre Proteine gezielt angreifen. Ein Beispiel dafür ist das Enzym Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT), das in verschiedenen Tumorentitäten aberrant aktiv ist. In-vitro-Analysen haben gezeigt, dass chemische Inhibitoren der NAMPT toxisch für Zellen des HL sein können. Deshalb ist davon auszugehen, dass die NAMPT als geschwindigkeitsbestimmendes Enzym des Nicotinamidadenindinukleotid (NAD⁺)-Stoffwechsels wichtig für das HL ist. Es ist jedoch noch unklar, ob eine Intervention der NAMPT-Aktivität auch in vivo das Lymphomwachstum von HL-Zellen hemmt. Ziel der vorliegenden Studie war es deshalb, ein präklinisches Xenograft-Modell zu nutzen. In dem In-ovo-Xenograft-Modell der Chorioallantoismembran des befruchteten Hühnereis (CAM) sollte untersucht werden, inwieweit die Inhibitoren FK866 und OT-82 die Lymphomentwicklung der L428-HL-Zellen verändern, sowie eine rot fluoreszierende, mCherry exprimierende Zelllinie für weiterführende In-ovo-Metabolismus-Analysen zu etablieren. Es wurden Zellen der HL-Zelllinie L428 auf die CAM appliziert, die zuvor 24 Stunden mit FK866, OT-82 oder zur Kontrolle mit DMSO behandelt wurden. Die entstandenen Läsionen wurden nach 96 Stunden geerntet und histologisch sowie morphologisch charakterisiert. Zusätzlich zur Oberfläche wurde das Volumen der Tumore mittels Mikro-Computertomographie (micro-CT) bestimmt. Die mit FK866 und OT-82 behandelten Zellen waren noch in der Lage, in ovo Lymphome zu bilden, sie waren aber kleiner, weniger durchblutet und von geringerer Zelldichte bei höherem Kollagengehalt. Die Tumorzellen waren allerdings positiv für den Proliferationsmarker Ki67. Somit führt die Behandlung mit NAMPT-Inhibitoren zu einer Reduzierung von Tumorgröße und -durchblutung, nicht jedoch zu einem vollständigen therapeutischen Effekt. Um zukünftige metabolische Analysen in ovo durchführen zu können, wurde eine Zelllinie etabliert, die das rot fluoreszierende Fusionsprotein mCherry-H2b exprimiert. Die hierbei etablierten Zelllinien reagierten in In-vitro- sowie in In-ovo-Studien ähnlich wie die parentale Zelllinie L428 auf die Behandlung mit den NAMPT-Inhibitoren FK866 und OT-82 hinsichtlich Zellviabilität, NAD+-Gehalt und NAMPT-Expression. Dies weist darauf hin, dass die etablierten Zelllinien für zukünftige Metabolismus-Analysen geeignet sind. Zusammengefasst konnte ein Xenograft-Modell etablieren, das zur Analyse der NAMPT-Aktivität und deren Einfluss auf die Lymphomentwicklung geeignet ist. Weiterhin konnten wir zeigen, dass die NAMPT-Inhibition Einfluss auf die Lymphomentwicklung in ovo haben. Somit steht ein neues präklinisches Modell zur Untersuchung des Lymphommetabolismus, beispielsweise durch Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie, zur Verfügung.
Schlagwörter: Hodgkin-Lymphom; CAM-Assay; NAMPT; NAMPT-Inhibitor