Sensibilisierung des triple-negativen Mammakarzinoms gegenüber Tamoxifen durch Hemmung des membranständigen Estrogenrezeptors GPER1

Sandrock, Lefke Johanna

Sensitization of triple-negative breast cancer to tamoxifen by inhibition of the membrane-bound estrogen receptor GPER1

by Lefke Johanna Sandrock

Doctoral thesis

Date of Examination:2025-04-07

Date of issue:2025-03-14

Advisor:Prof. Dr. Carsten Gründker

Referee:Prof. Dr. Carsten Gründker

Referee:PD Dr. Anja Uhmann

Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11140

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Format:PDF

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Abstract

English

Breast cancer that is negative for the estrogen receptor α (ER α), the progesterone receptor and the human epidermal growth factor receptor 2 is referred to as triple-negative breast cancer (TNBC). This tumor subtype is generally associated with a poor prognosis as it lacks expression of therapeutic targets such as ERα and is biologically more aggressive. To further explore the possibility of targeted therapies, this study investigated the G-protein coupled estrogen receptor 1 (GPER1) under the agonist 4-hydroxytamoxifen (4OHT) and the antagonist G36. The role of GPER1 in TNBC cells is currently controversial. The objective of the study is based on the previous results of the Gründker working group, which found an increase in sensitivity to tamoxifen when GPER1 was knocked down. The aim of this study was to clarify whether the same effect can be achieved by blocking GPER1 with the specific GPER1 inhibitor G36. Using qualitative polymerase chain reactions (qPCR), the Western blot method and immunocytological staining, the TNBC receptor criteria and the expression of GPER1 were confirmed in both cell lines. It was also shown that the cells express the estrogen receptor β (ER β). The influence of the treatment on the molecular biological cell properties was investigated using different methods. Cell viability was analyzed using the Alamarblue viability assay. Migration behavior was investigated using the gap closure assay and the scratch assay. The effect on stem cell properties was examined in colony and sphere formation assays. The results show that the cell lines used, HCC-1806 and MDA-MB-231, behave differently in many aspects and therefore no clear statement can be made about TNBC cells in general. While the combination treatment significantly inhibited viability in HCC-1806 cells and thus supports the initial hypothesis of this study, the treatment had no significant effect on MDA-MB-231 cells. As assumed, 4OHT had a positive effect on cell viability. The migration behavior was promoted in this cell line by the antagonist G36, which was in contrast to our expectations and the HCC-1806 cells. When looking at the stem cell properties, the complete inhibition of colony and sphere formation ability under 4OHT influence was striking, while G36 even significantly promoted these. The MDA-MB-231 cells developed morphological changes under the GPER1 antagonist that fit the epithelial-mesenchymal transition theory. The results presented here were able to confirm some of the prevailing findings in breast cancer research, while others were called into question. In general, the interaction of the agonists and antagonists used with other receptors, such as the ERβ, must be taken into account when considering the results. This could play a particularly important role in the restrictive effect on stem cell properties of 4OHT. The working hypothesis that inhibition of GPER1 leads to increased sensitivity of TNBC cells to tamoxifen could not be confirmed in this study. The influence on stem cell properties provides new approaches for subsequent investigations of GPER1 and its role in the targeted therapy of triple-negative breast cancer.

Keywords: G-protein coupled estrogen receptor 1; Breast Cancer; Tamoxifen; G36; Triple negativ breast cancer

German

Brustkrebs, der negativ für den Estrogenrezeptor α (ER α), den Progesteronrezeptor und den humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor 2 ist, wird als triple-negativer Brustkrebs (TNBC) bezeichnet. Dieser Tumorsubtyp ist im Allgemeinen mit einer schlechten Prognose verbunden, da ihm die Expression therapeutischer Ziele wie ERα fehlen und er biologisch aggressiver ist. Um die Möglichkeit zielgerichteter Therapien weiter zu ergründen, wurde in dieser Arbeit der G-Protein gekoppelte Estrogen Rezeptor 1 (GPER1) unter dem Agonisten 4-Hydroxytamoxifen (4OHT) und dem Antagonisten G36 untersucht. Die Rolle des GPER1 in TNBC Zellen gilt aktuell als umstritten. Die Zielsetzung der Arbeit beruht auf den vorherigen Ergebnissen der Arbeitsgruppe Gründker, die unter GPER1-Knock-down eine Zunahme der Sensibilität gegenüber Tamoxifen feststellten. Nachfolgend sollte in dieser Arbeit geklärt werden, ob derselbe Effekt durch Blockade des GPER1 mit dem spezifischen GPER1-Inhibitor G36 erreicht werden kann. Zur Überprüfung der Arbeitshypothese wurden TNBC Zellen der Linien HCC-1806 und MDA-MB-231 jeweils einzeln sowie in Kombination mit 4OHT und G36 behandelt und sowohl molekularbiologisch als auch proteinbiochemisch in verschiedenen Versuchen untersucht und die Ergebnisse analysiert. Mithilfe von qualitativen Polymerase-Kettenreaktionen (qPCR), dem Western Blot-Verfahren und immunzytologischer Färbung wurden die TNBC Rezeptor-Kriterien und die Expression von GPER1 in beiden Zelllinien bestätigt. Hier wurde außerdem nachgewiesen, dass die Zellen den Estrogenrezeptor β (ER β) exprimieren. Der Einfluss der Behandlung auf die molekularbiologischen Zelleigenschaften wurde mit unterschiedlichen Methoden untersucht. Zellviabilität wurde mithilfe des Alamarblue Viabilitätsassays analysiert. Das Migrationsverhalten wurde im Gap Closure Assay sowie im Scratch Assay untersucht. Die Auswirkung auf Stammzelleigenschaften wurde in Colony- und Sphere Formation Assays betrachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die verwendeten Zelllinien HCC-1806 und MDA-MB-231 in vielen Aspekten gegensätzlich verhalten und dadurch keine eindeutige Aussage über TNBC Zellen im Allgemeinen getroffen werden kann. Während die Kombinationsbehandlung die Viabilität in HCC-1806 Zellen signifikant inhibierte und damit die Ausgangsthese dieser Arbeit stützt, hatte die Behandlung bei MDA-MB-231 Zellen keine signifikante Auswirkung. 4OHT wirkte hier wie angenommen positiv auf die Zellviabilität. Das Migrationsverhalten wurde in dieser Zelllinie durch den Antagonisten G36 gefördert, was im Gegensatz zu unseren Erwartungen und den HCC-1806 Zellen stand. Auffällig bei Betrachtung der Stammzelleigenschaften war die vollständige Inhibition der Kolonie- und Sphärenbildungsfähigkeit unter 4OHT Einfluss, während G36 diese sogar signifikant förderte. Die MDA-MB-231 Zellen entwickelten unter dem GPER1 Antagonisten morphologische Änderungen, die zur epithelial-mesenchymalen Transitionstheorie passen. Die hier dargestellten Ergebnisse konnten einige der vorherrschenden Erkenntnisse der Brustkrebsforschung bestätigen, während andere in Frage gestellt wurden. Allgemein muss bei Betrachtung der Ergebnisse die Interaktion der verwendeten Agonisten und Antagonisten mit anderen Rezeptoren, wie dem ERβ, bedacht werden. Besonders in der einschränkenden Wirkung auf Stammzelleigenschaften von 4OHT könnte dies eine wichtige Rolle spielen. Die Arbeitshypothese, dass es durch eine Hemmung von GPER1 zu einer gesteigerten Sensibilität der TNBC-Zellen gegenüber Tamoxifen kommt, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Der Einfluss auf die Stammzelleigenschaften gibt hier neue Ansätze für anschließende Untersuchungen des GPER1 und seiner Rolle in der zielgerichteten Therapie des triple-negativen Mammakarzinoms.

Schlagwörter: Brustkrebs; Triple negatives Mammakarzinom; G-Protein gekoppelter Estrogenrezeptor; Tamoxifen