Etablierung von Mutagenesemethoden zur pathophysiologischen Analyse der Signalaktivität in B-Lymphozyten

Establishment of mutagenesis methods for pathophysiological analysis of signaling activity in B lymphocytes

by Jan Wilhelm Kus
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-04-28
Date of issue:2025-03-27
Advisor:Prof. Dr. Jürgen Wienands
Referee:Dr. Björn Chapuy
Referee:Prof. Dr. Lutz Walter
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11160

 

 

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Abstract

English

B cell receptor (BCR) signaling plays a crucial role in B cell activation, differentiation, and immune response. Dysregulation of this pathway is associated with various immunodeficiencies and B cell malignancies. This study focuses on the establishment of a CRISPR/Cas9-based gene editing protocol for primary human B lymphocytes to investigate the functional impact of mutations in key signaling components, specifically SLP65 and CIN85. By optimizing electroporation conditions and delivery strategies, a highly efficient mutagenesis approach was developed that enables targeted genetic modifications in primary B cells without compromising cell viability. Functional analyses, including calcium mobilization assays and protein interaction studies, revealed significant alterations in intracellular signaling cascades following the disruption of SLP65 and CIN85. These findings provide valuable insights into the molecular mechanisms governing BCR signal transduction and highlight the potential for gene-editing technologies to advance our understanding of B cell-related immune disorders. Furthermore, the established methodology offers a platform for studying genetic polymorphisms associated with B cell dysfunctions and developing targeted therapeutic interventions.
Keywords: CIN85 / SH3KBP1; B cell receptor signaling; CRISPR/Cas9 gene editing; Primary human B cells; Electroporation; SLP65 / BLNK

German

Die Signalübertragung des B-Zell-Rezeptors (BZR) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung, Differenzierung und Immunantwort von B-Zellen. Eine Fehlregulation dieses Signalwegs ist mit verschiedenen Immundefekten und B-Zell-Malignomen verbunden. In dieser Studie wurde ein CRISPR/Cas9-basiertes Geneditierungsprotokoll für primäre humane B-Lymphozyten etabliert, um die funktionellen Auswirkungen von Mutationen in zentralen Signalproteinen, insbesondere SLP65 und CIN85, zu untersuchen. Durch die Optimierung der Elektroporationsbedingungen und der Gentransferstrategien wurde eine hocheffiziente Mutagenesemethode entwickelt, die gezielte genetische Modifikationen in primären B-Zellen ermöglicht, ohne deren Überlebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Funktionelle Analysen, darunter Kalzium-Mobilisierungsassays und Protein-Interaktionsstudien, zeigten erhebliche Veränderungen in intrazellulären Signalwegen nach der Inaktivierung von SLP65 und CIN85. Diese Ergebnisse liefern wertvolle Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der BZR-Signalübertragung und unterstreichen das Potenzial der Geneditierung zur Erforschung von B-Zell-assoziierten Immunerkrankungen. Darüber hinaus bietet die etablierte Methodik eine Plattform zur Untersuchung genetischer Polymorphismen, die mit B-Zell-Dysfunktionen in Verbindung stehen, und könnte zur Entwicklung gezielter therapeutischer Ansätze beitragen.
Schlagwörter: B-Zell-Rezeptor Signalkaskade; CRISPR/Cas9-Geneditierung; Elektroporation; CIN85 / SH3KBP1; SLP65 / BLNK; primäre humane B-Zellen
 
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