NTRK-Alterationen in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen
NTRK alterations in non-small cell lung cancer
by Annika Reiffert
Date of Examination:2025-03-31
Date of issue:2025-03-31
Advisor:Prof. Dr. Philipp Ströbel
Referee:Prof. Dr. Annalen Bleckmann
Referee:Prof. Dr. Dieter Kube
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11188
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Abstract
English
Alterations, especially gene fusions, of the NTRK gene family, consisting of NTRK1, NTRK2 and NTRK3, represent a rare, but therapeutically potentially addressable driver in non-small cell lung carcinomas. Constitutive activation or overexpression caused by alterations of the tropomyosin-related kinases encoded by them (respectively TrkA, TrkB, and TrkC) can lead to uncontrolled cell growth and thus to carcinogenesis due to their physiological effects such as cell proliferation and apoptosis inhibition. The low prevalence of therapeutically addressable NTRK gene fusions makes it challenging for molecular pathology to reliably detect this rare phenomenon in order to offer the corresponding patients the highly effective therapy with a specific tyrosine kinase inhibitor. Alterations of other kinds, such as splice variants, amplifications, or point mutations, are also described, but their expression and effect on oncogenesis are not clearly classified. For this study, a cohort of 1080 consecutive, non-preselected cases of non-small cell lung carcinomas that were treated at the Institute of Pathology at the University of Göttingen between December 2016 and June 2018, were examined for NTRK alterations using different methods. Most of the cases initially underwent immunohistochemical testing for Trk expression, which, if positive, was supplemented by testing the cause with RNA-based next generation sequencing and/or fluorescence in situ hybridization. Some immunohistochemically negative cases were also examined using these methods for comparability. In addition to the prior classification of immunohistochemistry into "positive" and "negative", the intensity and subcellular location of the staining were evaluated and sorted using a score in the context of this work. Another part of the cases was examined by fluorescence in situ hybridization as the only method. An alteration of any kind of NTRK1, -2, or -3 was determined in 23 cases (2.1%). Gene fusions occurred in two cases at 0.19 %: A SQSTM1-NTRK1 and EPS15-NTRK1 fusion was identified in two adenocarcinomas in male patients and their carriers were given tyrosine kinase inhibitor therapy. Immunohistochemically, both cases showed strongly positive (rank 1 and 7 among 169 positive cases) and did not show mutations in other prominent drivers (EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, MET), which likely makes the NTRK fusion the primary driver. Ten cases showed an increase in copy number (above four) of one or more NTRK genes in fluorescence in situ hybridization, which was associated with immunohistochemical positivity in 90 %. In a total of twelve cases, alternative splice variants of the three Trk proteins could be detected, including seven cases of exon 12 skipping (85.7% immunohistochemically positive) and three cases of exon 10 skipping (100% immunohistochemically positive) each of NTRK2. The disease value of splice variants and increased gene copy numbers cannot be determined conclusively with the available data and is also a subject of discussion in the literature. While testing only for translocations by fluorescence in situ hybridization proved to be too time-consuming and material-consuming in a cohort with such low prevalence, an approach with primary immunohistochemistry and sequential RNA-based next generation sequencing proved to be reliable in detecting the present NTRK fusions and splice variants. For the detection of amplifications, FISH was a more suitable, if not ideal method. In the context of the latest literature, an RNA-based detection method is favored for NTRK alterations in non-small cell lung carcinomas. Splice variants and amplifications of NTRK should be closely examined for their oncogenic potential and therapeutic addressability as potentially addressable mutations.
Keywords: ntrk; ntrk fusions; nsclc; ntrk splice variant; ntrk amplification; non-small cell lung cancer; panTrk immunohistochemistry; fluorescence in-situ hybridization; rna-based ngs; ntrk alterations; targeted therapy
German
Alterationen, insbesondere Genfusionen, der NTRK-Genfamilie, bestehend aus NTRK1, NTRK2 und NTRK3, stellen einen seltenen, aber therapeutisch potentiell adressierbaren Treiber in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen dar. Durch Alterationen bedingte konstitutive Aktivierung oder Überexpression der durch sie kodierten Tropomyosin-related-Kinasen (respektive TrkA, TrkB und TrkC) können deren physiologische Effekte wie Zellproliferation und Apoptosehemmung zu einem unkontrollierten Zellwachstum und damit zur Kanzerogenese führen. Die niedrige Prävalenz der therapeutisch adressierbaren NTRK-Genfusionen bedingt die Herausforderung der Molekularpathologie, dieses seltene Phänomen zuverlässig zu erkennen, um den entsprechenden Patient*innen die hocheffektive Therapie mit einem spezifischen Tyrosinkinaseinhibitor zukommen zu lassen. Alterationen anderer Art wie Spleißvarianten, Amplifikationen oder Punktmutationen sind ebenfalls beschrieben, in ihrer Expression und ihrem Effekt auf die Onkogenese jedoch nicht eindeutig klassifiziert. Für diese Arbeit wurde eine Kohorte von 1.080 konsekutiven, nicht vorselektierten Fälle nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome, die zwischen Dezember 2016 und Juni 2018 im Institut für Pathologie der Universitätsmedizin Göttingen bearbeitet wurden, mittels unterschiedlicher Methoden auf NTRK-Alterationen untersucht. Der Großteil der Fälle erhielt zunächst eine immunhistochemische Testung auf eine Trk-Expression, die bei Positivität durch eine Testung der Ursache mit RNA-basierter next generation-Sequenzierung und/ oder Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung ergänzt wurde. Auch einige immunhistochemisch negative Fälle wurden zur Vergleichbarkeit mit diesen Methoden untersucht. Neben der vorausgegangenen Klassifizierung der Immunhistochemie in „positiv“ und „negativ“ wurden Intensität und subzelluläre Lokalisation der Färbung im Rahmen dieser Arbeit mittels eines Scores beurteilt und sortiert. Ein anderer Teil der Fälle wurde als einzige Methode per Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung untersucht. In 23 Fällen (2,1%) konnte eine Alteration jeglicher Art von NTRK1, -2- oder -3 ermittelt werden. Genfusionen traten mit zwei Fällen zu 0,19% auf: Eine SQSTM1-NTRK1- und eine EPS15-NTRK1-Fusion wurden in zwei Adenokarzinomen männlicher Patienten identifiziert und ihre Träger einer Tyrosinkinaseinhibitortherapie zugeführt. Immunhistochemisch zeigten sich beide Fälle stark positiv (Rang 1 und 7 unter 169 positiven Fällen) und wiesen in anderen prominenten Treibern (EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, MET) keine Mutationen auf, was die NTRK-Fusion als primären Treiber wahrscheinlich macht. Zehn Fälle wiesen in der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung eine Vermehrung der Kopienzahl (über vier) eines oder mehrerer NTRK-Gene auf, die zu 90% mit einer immunhistochemischen Positivität einherging. In insgesamt zwölf Fällen konnten alternative Spleißvarianten der drei Trk-Proteine nachgewiesen werden, darunter sieben Fälle eines Exon 12-skippings (zu 85,7% immunhistochemisch positiv) und drei Fälle eines Exon 10-skippings (100% immunhistochemisch positiv) jeweils von NTRK2. Der Krankheitswert der Spleißvarianten und Genkopienzahlerhöhungen lässt sich mit den vorliegenden Daten nicht eindeutig bestimmen und ist auch im Literaturkontext Gegenstand von Diskussionen. Während sich die alleinige Testung auf Translokationen per Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung als zu zeit- und materialaufwändig in einer Kohorte mit so niedriger Prävalenz zeigte, erwies sich ein Vorgehen mit primärer Immunhistochemie und sequentieller RNA-basierter next generation-Sequenzierung als zuverlässig, um die vorliegenden NTRK-Fusionen und -Spleißvarianten zu erkennen. Für das Ermitteln von Amplifikationen war die FISH eine geeignetere, wenn auch nicht ideale Methode. Im Kontext der aktuellsten Literatur wird für NTRK-Alterationen in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen eine RNA-basierte Nachweismethode favorisiert. Spleißvarianten und Amplifikationen von NTRK sollten als potentiell adressierbare Mutationen näher auf ihr onkogenes Potenzial und therapeutische Adressierbarkeit untersucht werden.
Schlagwörter: NTRK; NTRK-Alterationen; NTRK-Fusionen; NTRK-Spleißvariante; NTRK-Amplifikation; Immunhistochemie; Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung; RNA-basierte NGS; Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; NSCLC; panTrk-Immunhistochemie
