Die Rolle von OPN5 als UV-Licht-sensitiver G-Protein gekoppelter Rezeptor in Melanozyten
The role of OPN5 as UV-light-sensitive G protein coupled receptor in melanocytes
by Carolin Christiane Katharina Radnik
Date of Examination:2025-04-16
Date of issue:2025-04-02
Advisor:Prof. Dr. Tobias Brügmann
Referee:Prof. Dr. Dr. Tobias Brügmann
Referee:Prof. Dr. Björn Chapuy
Sponsor:Else Kröner-Fresenius-Stiftung
Sponsor:UMG Promotionskolleg
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11185
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Format:PDF
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Abstract
English
The UV-A component (~380 nm) of sunlight leads to the pigmentation of the skin, which temporarily protects it from sunburn and DNA damage, and over the long term prevents the development of tumors, such as malignant melanomas. The production of melanin in melanocytes is responsible for this effect. It has been previously assumed that UV-A light activates Gq proteins in melanocytes via retinal-dependent mechanisms. These proteins activate a cascade that leads, through several steps, to the influx of Ca2+ ions from the extracellular space and intracellular stores. The increase in Ca2+ concentration supports the formation of mitochondrial reactive oxygen species (ROS). These signal molecules of phototransduction lead to the release and synthesis of melanin. However, it is not yet known what exactly triggers the activation of the Gq proteins. Human neuropsin 5 (hOPN5) is the only known protein in humans with a peak activity in the UV range at λ_max = 380 nm, making it a potential candidate. hOPN5 can be detected at the mRNA level in human melanocytes and keratinocytes. hOPN5 is Gq-protein-coupled and has been identified in various animals across different organs. In this study, the response of melanoma cells and melanocytes to UV light was measured using Ca2+ imaging. It was found that cells in which a hOPN5 knockout was performed using CRISPR/Cas9 responded to light in the same way as cells with normal hOPN5 expression. Furthermore, melanoma cell lines with higher hOPN5 expression did not show a better response to light compared to cell lines with lower expression. It was demonstrated that hOPN5 is not the receptor that detects UV light in melanocytes and melanoma cells and initiates the signaling cascade leading to the release and synthesis of melanin. Additionally, the addition of the new specific Gq blockers FR900359 and YM-245890 revealed that, contrary to previous assumptions, the cascade is not Gq-protein-coupled. It is possible that the receptor is Gi-coupled, as this protein can also lead to Ca2+ influx through multiple intermediate steps. The unknown mechanism of UV light reception was further investigated. It was found that the integration time and half-maximal activation of the receptor in melanocytes and the selected melanoma cell line were not different. By incubating the cells with N-acetylcysteine and subsequent Ca2+ imaging, it was demonstrated that, as previously suspected, reactive oxygen species (ROS) influence the UV light response. Furthermore, the cells were incubated with different retinal isoforms. A poor response was observed when incubating with 11-cis-retinal, which may be explained by the short half-life of this isoform. This hypothesis was not further pursued in this study, and therefore, the hypothesis could neither be confirmed nor refuted. No differences in sensitivity or response strength were found with 9-cis-retinal or all-trans-retinal. This suggests the presence of an isomerase in the cells that interconverts the retinal forms. A long exposure of the cells to UV light leads to a two-phase activation of UV light reception. The first phase of excitation is dependent on retinal. The second phase could not be clearly attributed to either all-trans-retinal or reactive oxygen species (ROS). Incubating the cells in complete darkness for 12-60 hours and subsequent Ca2+ imaging demonstrated that the pre-treatment of the cells had no impact on the UV light response but led to an increase in hOPN5 expression at the mRNA level. In summary, the UV light reception shows a long integration time with a half-maximal light intensity for receptor activation of around 0.6 mW/mm². This is logical, as the sun's radiation has a relatively low intensity over long periods of time. In conclusion, the following can be stated: UV light reception is not, as previously assumed, Gq-protein-coupled. hOPN5 does not play a role in the cascade that ultimately leads to the release and synthesis of melanin. Reactive oxygen species influence the UV light response in melanocytes and melanoma cells.
Keywords: OPN5; Melanocytes; Gq-Proteins; Phototransduction; Malanoma; UV-A-Light
German
Der UV-A Anteil (~380 nm) von Sonnenlicht führt zur Pigmentierung der Haut, was diese kurzfristig vor Sonnenbrand und DNA-Schäden schützt und langfristig die Entstehung von Tumoren, wie malignen Melanomen, verhindert. Hierfür ist die Melaninproduktion in Melanozyten verantwortlich. Bisher wurde angenommen, dass UV-A-Licht in Melanozyten zur Retinal-abhängigen Aktivierung von Gq-Proteinen führt. Diese aktivieren eine Kaskade, die über mehrere Schritte zum Einstrom von Ca2+-Ionen aus dem Extrazellularraum und aus intrazellulären Speichern führt. Der Anstieg der Ca2+-Konzentration unterstützt die Bildung von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies. Diese Signalmoleküle der Phototransduktion führen zur Freisetzung und Synthese von Melanin. Bisher ist nicht bekannt, was genau zur Aktivierung der Gq-Proteine führt. Humanes Neuropsin 5 (hOPN5) ist das einzige im Menschen bekannte Protein mit einem Wirkmaximum im UV-Bereich bei λmax=380 nm. Es ist damit ein möglicher Kandidat. hOPN5 kann in humanen Melanozyten und Keratinozyten auf mRNA-Ebene nachgewiesen werden. hOPN5 ist Gq-Protein gekoppelt und in verschiedensten Tieren in unterschiedlichsten Organen nachzuweisen. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe von Ca2+-Imaging die Reaktion von Melanomzellen und Melanozyten auf UV-Licht gemessen. Dabei wurde festgestellt, dass Zellen an denen mit Hilfe von CRISPR/Cas9 ein hOPN5-Knock-out durchgeführt wurde, genauso gut auf Licht reagieren, wie Zellen mit normaler hOPN5-Expression. Zusätzlich wurde festgestellt, dass Melanomzelllinien mit einer höheren hOPN5-Expression nicht besser auf Licht reagieren als Zelllinien mit einer niedrigen Expression. Es konnte gezeigt werden, dass hOPN5 nicht der Rezeptor ist, der UV-Licht in Melanozyten und Melanomzellen detektiert und die Signalkaskade zur Ausschüttung und Bildung von Melanin in Gang setzt. Außerdem konnte durch die Zugabe der neuen spezifischen Gq-Blocker FR900359 und YM-245890 nachgewiesen werden, dass die Kaskade, nicht wie bisher angenommen, Gq-Protein-gekoppelt ist. Es besteht die Möglichkeit, dass der Rezeptor Gi-gekoppelt ist, da auch dieses Protein über mehrere Zwischenschritte zum Ca2+-Einstrom führen kann. Der unbekannte Mechanismus der UV-Licht-Rezeption wurde weiter untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass sich die Integrationszeit und die halbmaximale Aktivierung des Rezeptors in den Melanozyten und der gewählten Melanomzelllinie nicht unterscheiden. Durch die Inkubation der Zellen mit N-Acetylcystein und anschließendem Ca2+-Imaging wurde nachgewiesen, dass, wie bisher vermutet, reaktive Sauerstoffspezies einen Einfluss auf die UV-Licht Antwort haben. Des Weiteren wurden die Zellen mit verschiedenen Retinal-Isoformen inkubiert. Hierbei wurde eine schlechte Reaktion bei der Inkubation mit 11-cis-Retinal gemessen. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die geringe Halbwertszeit dieser Isoform. Dieser Vermutung wurde in dieser Arbeit nicht weiter nachgegangen, daher konnte die These weder bewiesen noch widerlegt werden. Bei 9-cis-Retinal und all-trans-Retinal wurden keine Unterschiede in der Sensibilität und in der Stärke der Reaktion festgestellt. Das legt nah, dass es in den Zellen eine Isomerase gibt, die die Retinalformen ineinander umwandelt. Eine lange Bestrahlungsdauer der Zellen führt zwar zu einer zweizeitigen Aktivierung des UV-Licht-Rezeption. Für die erste Phase der Erregung ist ein Retinal obligat. Die zweite Phase konnte weder dem all-trans-Retinal, noch den reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) klar zugeordnet werden. Durch die Inkubation der Zellen über 12-60 h in absoluter Dunkelheit und anschließendem Ca2+-Imaging, wurde gezeigt, dass die Vorbehandlung der Zellen keinen Einfluss auf die UV-Licht-Reaktion hat, aber zu einem Anstieg der hOPN5-Expression auf mRNA-Ebene führt. Zusammenfassend zeigt die UV-Licht-Rezeption eine lange Integrationszeit bei einer halbmaximalen Lichtintensität zur Aktivierung des Rezeptors von um die 0,6 mW/mm². Das erscheint sinnvoll, da die Sonne lange mit eher niedriger Intensität auf die Zellen scheint. Abschließend kann aus dieser Arbeit folgendes festgehalten werden: Die UV Licht Rezeption ist nicht, wie bisher angenommen, Gq-Protein-gekoppelt. hOPN5 spielt keine Rolle in der Kaskade, die am Ende zur Ausschüttung und Synthese von Melanin führt. Reaktive Sauerstoffspezies haben einen Einfluss auf die UV-Licht-Reaktion von Melanozyten und Melanomzellen.
Schlagwörter: OPN5; Melanozyten; Gq-Proteine; Fototransduktion; UV-A-Licht; Melanome
