Role of root exudates as signals in the interaction of Brassica napus L. roots with Verticillium longisporum in the soil

by Sarenqimuge Sarenqimuge
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-11-13
Date of issue:2025-04-03
Advisor:Prof. Dr. Andreas von Tiedemann
Referee:Prof. Dr. Andreas von Tiedemann
Referee:Prof. Dr. Klaus Dittert
Referee:Martin Freudiger (Maier)
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11179

 

 

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Format:PDF
Description:doctoral thesis

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Abstract

English

Verticillium longisporum is a soil-borne pathogen that primarily infects brassicaceous plants, including oilseed rape, a major global source of vegetable oil and oil extraction meal. V. longisporum causes stem striping disease in oilseed rape, which has triggered concern in various regions. In Europe, the disease ranks as the sixth most prevalent biotic stress on oilseed rape. V. longisporum operates as a monocyclic pathogen in oilseed rape, progressing through dormant, biotrophic, and necrotrophic stages. In the dormant stage, V. longisporum can survive for many years in the soil as its dormant structures, microsclerotia. Upon the presence of oilseed rape, these structures can germinate, infect the root of host plant, and systematically colonize the stem. At crop maturity, V. longisporum can produce microsclerotia again beneath the stem epidermis and within the stem pith. These microsclerotia return to the soil with crop residues, awaiting the next susceptible crops to infect. Since microsclerotia are central to the disease cycle of V. longisporum and serve as the primary reservoirs of inoculum, studying these resilient structures—particularly their germination and dormancy—is critical. Understanding these processes could allow us to artificially manipulate the dormancy and germination of microsclerotia, providing a novel method to control this devastating disease. In this study, we first investigated the factors and mechanisms that keep microsclerotia dormant in the soil. To determine if the dormancy of microsclerotia was due to a lack of nutrients or competition for nutrients with other soil microorganisms, we cultured microsclerotia in various nutrient solutions and in water under sterile conditions. Our findings indicated that microsclerotia could germinate without external nutrients, provided there was sufficient water, suggesting that nutrient deficiency is not responsible for dormancy. This insight led us to explore the potential antibiosis effects in the soil. To test this hypothesis, we cultured microsclerotia in both autoclaved and non-autoclaved natural soil. The results showed that natural soil, rich in microorganisms, significantly inhibited the germination of microsclerotia, whereas in autoclaved soil, where microorganisms were absent, microsclerotia successfully germinated. This confirmed that soil microorganisms are the primary factor maintaining the dormancy of microsclerotia in the soil. To identify the specific factors with this germination-suppressing effect, we isolated soil bacteria and conducted in vitro bioassays. Our studies revealed that all tested soil bacteria exerted a general inhibitory effect on microsclerotia. Further investigation identified volatile organic compounds (VOCs), specifically volatile fatty acids produced by these bacteria, as the substances responsible for inhibiting the germination of V. longisporum microsclerotia. Next, we examined which factors stimulate the germination of microsclerotia in the soil, previously suppressed by soil bacteria. Early studies suggested that root exudates might trigger the germination of microsclerotia in the soil. Building on this premise, our research also accounted for the effects of soil bacteria when exploring the interactions between plants and microsclerotia. We investigated the impact of root exudates from both host and non-host plants on microsclerotia whose germination was inhibited by soil bacteria. Our findings indicated that root exudates from both host and mon-host plant could counteract the bacterial inhibitory effect and induce germination. To identify specific active compounds, we separated the root exudates into polar and non-polar fractions and assessed their effects on the germination-suppressed microsclerotia. Results highlighted the significant role of polar compounds, particularly glutamic acid, which exhibited the strongest stimulatory effect on microsclerotia germination. Additionally, we explored how root exudates overcome bacterial suppression and induce the germination of microsclerotia. Our study indicated that while the root exudates did not affect the viability of the bacteria, they altered bacterial metabolites, particularly those that inhibit the germination of microsclerotia. Finally, we conducted a basic study on the molecular mechanisms underlying the dormancy and germination of microsclerotia, particularly focusing on the influence of soil bacteria on these processes. Gene Ontology (GO) analysis of differentially expressed genes revealed significant enrichment of several GO terms among germinated, dormant, and germination-suppressed microsclerotia. These findings indicate profound molecular differences across these three stages, which could potentially offer new targets for the development of novel fungicides or biological control agents. Specifically, the molecular differences between dormant and germination-suppressed microsclerotia suggest that soil bacteria actively alter the molecular pathways within dormant microsclerotia, thereby effectively suppressing their germination. This interaction highlights a crucial role of microbial activity in modulating lifecycle of microsclerotia, providing further insight into how microbial environments influence pathogen behavior. To summarize, our study systematically examined the factors and mechanisms governing the dormancy and germination of microsclerotia in the soil. This research has laid a fundamental groundwork for developing new strategies to control this disease.
Keywords: Oilseed rape, Verticillium disease, Root exudates, Plant-pathogen interaction, Soil bacteria, Volatile compounds, Dormancy and germination

German

Verticillium longisporum ist ein bodenbürtiger Erreger, der hauptsächlich Kreuzblütler-Pflanzen wie Raps infiziert, welcher eine wichtige globale Quelle für Pflanzenöl und Ölmehl darstellt. Die durch V. longisporum verursachte Krankheit an Raps ist die Stängelstreifigkeit, die in verschiedenen Regionen Besorgnis hervorgerufen hat. In Europa gilt die Krankheit als der sechsthäufigste biotische Stressfaktor für Raps. V. longisporum agiert als ein monozyklischer Pathogen im Raps und durchläuft dabei ruhende, biotrophe und nekrotrophe Phasen. Im Ruhezustand kann V. longisporum viele Jahre im Boden überleben, in Form seiner dauerhaften Strukturen, den Mikrosklerotien. Bei Anwesenheit von Raps können diese Strukturen keimen und die Wurzeln der Wirtspflanze infizieren. Anschließend besiedeln sie systematisch den Stängel. Während der Ernte bildet er erneut Mikrosklerotien unterhalb der Stängelepidermis und im Mark des Stängels. Diese Mikrosklerotien gelangen mit den Ernterückständen zurück in den Boden und warten auf die nächsten anfälligen Kulturen zur Infektion. Da Mikrosklerotien im Krankheitszyklus von V. longisporum zentral sind und als primäre Inokulumreservoire fungieren, ist die Untersuchung dieser widerstandsfähigen Strukturen – insbesondere ihrer Keimung und Dormanz – von entscheidender Bedeutung. Ein vertieftes Verständnis dieser Prozesse könnte es ermöglichen, die Dormanz und Keimung der Mikrosklerotien gezielt zu manipulieren und dadurch neue Ansätze zur Kontrolle dieser Krankheit zu entwickeln. In dieser Studie untersuchten wir zunächst die Faktoren und Mechanismen, die Mikrosklerotien im Boden in einem Ruhezustand halten. Um zu bestimmen, ob die Dormanz der Mikrosklerotien durch einen Mangel an Nährstoffen (z.B durch Konkurrenz um Nährstoffe mit anderen Bodenmikroorganismen) verursacht wird, kultivierten wir Mikrosklerotien in verschiedenen Nährlösungen und auch in Wasser unter sterilen Bedingungen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Mikrosklerotien in der Lage sind zu keimen, auch wenn externe Nährstoffe fehlen, solange ausreichend Wasser vorhanden ist. Dies deutet darauf hin, dass ein Nährstoffmangel nicht für den Ruhezustand verantwortlich ist. Diese Erkenntnis führte uns zur Untersuchung möglicher Antibiose-Effekte im Boden. Zur Überprüfung dieser Hypothese kultivierten wir Mikrosklerotien sowohl in autoklaviertem als auch in nicht autoklaviertem natürlichen Boden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass natürlicher, mikroorganismenreicher Boden die Keimung der Mikrosklerotien erheblich hemmte. Im Gegensatz dazu keimten die Mikrosklerotien erfolgreich in autoklaviertem Boden, wo keine Mikroorganismen vorhanden waren. Dies bestätigte, dass Bodenmikroorganismen der primäre Faktor sind, der die Dormanz von Mikrosklerotien im Boden aufrechterhält. Um die spezifischen Faktoren mit diesem keimungshemmenden Effekt zu identifizieren, isolierten wir Bodenbakterien und führten in-vitro-Bioassays durch. Unsere Studien ergaben, dass sämtliche getesteten Bodenbakterien einen generellen hemmenden Effekt auf Mikrosklerotien hatten. Weiterführende GC-MS-Analysen identifizierten flüchtige organische Verbindungen (VOCs), insbesondere flüchtige Fettsäuren, als die Substanzen, die für die Hemmung der Keimung von V. longisporum Mikrosklerotien verantwortlich sind. Als Nächstes untersuchten wir, welche Faktoren die Keimung von Mikrosklerotien im Boden anregen, die zuvor durch Bodenbakterien unterdrückt wurden. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass Wurzelexsudate die Keimung von Mikrosklerotien im Boden auslösen könnten. Basierend auf dieser Annahme berücksichtigte unsere Forschung auch die Effekte von Bodenbakterien auf die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikrosklerotien. Wir untersuchten die Wirkung von Wurzelexsudaten sowohl von Wirts- als auch von Nicht-Wirtspflanzen auf Mikrosklerotien, deren Keimung durch Bodenbakterien gehemmt wurde. Unsere Ergebnisse zeigten, dass beide Arten von Wurzelexsudaten den bakteriellen Hemmeffekt ausgleichen und die Keimung induzieren konnten. Zur Identifizierung spezifischer aktiver Verbindungen wurden die Wurzelexsudate in polare und nicht-polare Fraktionen aufgeteilt und ihre Auswirkungen auf die keimungshemmenden Mikrosklerotien bewertet. Die Ergebnisse unterstrichen die herausragende Bedeutung polarer Verbindungen, insbesondere von Glutaminsäure, die den stärksten stimulierenden Effekt auf die Keimung von Mikrosklerotien aufwies. Des Weiteren wurde untersucht, wie Wurzelexsudate die bakterielle Unterdrückung überwinden und die Keimung von Mikrosklerotien induzieren können. Die Studie ergab, dass die Wurzelexsudate zwar keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Bakterien hatten, jedoch die bakteriellen Metaboliten beeinflussten, insbesondere jene, die die Keimung von Mikrosklerotien hemmen. Schließlich führten wir eine grundlegende Studie zu den molekularen Mechanismen durch, die der Dormanz und Keimung von Mikrosklerotien zugrunde liegen. Die Genontologie (GO)-Analyse zeigte eine signifikante Anreicherung mehrerer GO-Terme bei gekeimten, ruhenden und keimungshemmenden Mikrosklerotien. Diese Ergebnisse deuten auf bedeutende molekulare Unterschiede zwischen diesen drei Stadien hin, welche möglicherweise neue Zielstrukturen für die Entwicklung innovativer Fungizide oder biologischer Kontrollmittel darstellen können. Die molekularen Unterschiede zwischen ruhenden und keimungshemmenden Mikrosklerotien lassen besonders darauf schließen, dass Bodenbakterien aktiv die molekularen Pfade innerhalb der ruhenden Mikrosklerotien verändern und dadurch deren Keimung effektiv unterdrücken. Diese Wechselwirkung unterstreicht die entscheidende Rolle der mikrobiellen Aktivität bei der Modulation des Lebenszyklus von V. longisporum und bietet weitere Einblicke, wie mikrobielle Umgebungen das Verhalten von Pathogenen beeinflussen können. Zusammenfassend hat unsere Studie systematisch die Faktoren und Mechanismen erforscht, die die Dormanz und Keimung von Mikrosklerotien im Boden steuern. Diese Forschung legt eine solide Grundlage für die Entwicklung neuartiger Strategien zur Bekämpfung dieser Krankheit.
 
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