Die einwärtsgleichrichtenden Kaliumströme IK1 und IK,ACh in atrialen Kardiomyozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und ihr Remodelling unter in-vitro Feldstimulation
The inward rectifying potassium currents IK1 and IK,ACh in atrial cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells and their remodeling under in vitro field stimulation
by Robin Springer
Date of Examination:2025-04-10
Date of issue:2025-04-09
Advisor:Prof. Dr. Niels Voigt
Referee:Prof. Dr. Katrin Streckfuß-Bömeke
Referee:Prof. Dr. Stephan E. Lehnart
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11164
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Abstract
English
Atrial fibrillation is the most common sustained supraventricular arrhythmia in humans and is associated with an immense increase in the risk of stroke. Many key questions about the development and therefore also the targeted treatment of this disease are still not understood. So far, animal models have not been able to answer these questions due to the interspecific differences in electrophysiological properties. Cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells have developed into a promising tool in cardiovascular research over the last decade. A cell model based on iPSC cardiomyocytes of atrial phenotype could help to better understand this disease and thus pave the way for new treatment options. To this end, iPSC cardiomyocytes were treated with retinoic acid and then the basal inward rectifying potassium current IK1 and the atrial specific acetylcholine activated current IK,ACh were analyzed using the voltage-clamp method. iPSC cardiomyocytes of ventricular differentiation served as control. In a second step, these atrial iPSC-KMs were examined for changes in these currents in the context of in-vitro tachypacing experiments and assessed against the background of atrial remodeling in atrial fibrillation. The barium-sensitive basal current (IK1) elicited by a ramped voltage protocol from -100 mV to -40 mV showed no significant difference between the two phenotypes. On the other hand, in the atrial IPSC-KMs, carbachol (2 µM; IK,ACh) showed a clear current increase, whereas less than 10% of the ventricular cells (3/32) showed a current increase, which is consistent with the 90% purity of the ventricular phenotype from other studies. In isolated cells from an atrial iPSC cardiomyocyte-based tissue model (EHM), both IK1 and IK,ACh were shown to be conserved and equally expressed in these cells. IK,ACh activated by carbachol in a concentration-dependent manner showed the same characteristic course described in human cardiomyocytes with a peak and a QSS current and a decrease in current increase with repeated activation. Furthermore, neither in the presence of the M-receptor blocker atropine (1 µM) nor in the presence of the selective IK,ACh blocker tertiapine (100nM) could a current increase be induced by carbachol, indicating that IK,ACh is activated via a muscarinic acetylcholine receptor as in human tissue and mediated by a so-called GIRK channel. Since the basal current remained unchanged under tertiapine, it can also be assumed that it is only formed by IK1 as under physiological conditions and that there is no receptor-independent activity of IK,ACh. In addition to carbachol, adenosine (1 mM) was also able to induce a concentration-dependent increase in current corresponding to IK,ACh (here IK,Ado), as in human atrial cardiomyocytes. It could be shown that in-vitro tachypacing at 3 Hz is sufficient to induce changes in IK,ACh compared to a 1 Hz control group. While no significant changes could be observed after a stimulation period of 15 h, a weak tertiapine-sensitive component of the basal current could be measured after 24 h. A change of the cell medium during stimulation with an increase of the calcium content from 0.42 to 1.8 mM finally led to a significant reduction of both peak and QSS- IK,ACh as well as to a tertiapine-sensitive component of the basal current of almost 30%. Although no significant change in the absolute basal current could be generated under any of the stimulation conditions, the described changes in IK,ACh suggest a potential calcium-dependent remodeling as described in human cells from patients with paroxysmal or chronic atrial fibrillation. A major strength of iPSC cardiomyocytes is that, unlike human cardiomyocytes, they can be kept in culture for long periods. It was therefore possible to use these cells to investigate recovery from tachypacing. It was shown that the induced changes in IK,ACh are potentially reversible, so that the present cell model seems suitable for investigating the temporal processes of remodeling of VHF in more detail. The work shows that cardiomyocytes generated from human pluripotent stem cells of atrial phenotype express a functional, stable IK,ACh at a level that allows the investigation and induction of changes in the current. Using in vitro tachypacing, the IK,ACh-related remodeling of VHF could be replicated in iPSC cardiomyocytes and reversed in a next step. This results in a promising cell model, which in a further step should serve as the basis for a tissue model (EHM) based on iPSC cardiomyocytes and thus enable the investigation of tachypacing-induced remodeling, taking into account the physiological cell-cell interaction, as well as the application of further investigation methods and (pharmacological) tests.
Keywords: Atrial Fibrillation; Human Induced Pluripotent Stem Cells; Inward-rectifier potassium channel; IK,ACh; IK1; hiPSC-Kadiomyocytes; Cardiology; Pharmacology; in-vitro Tachypacing
German
Vorhofflimmern ist die häufigste anhaltende supraventrikuläre Herzrhythmusstörung des Menschen und ist mit einer immensen Erhöhung des Schlaganfallrisikos assoziiert. Noch immer sind viele Kernfragen zur Entstehung und damit auch zur zielgerichteten Behandlung dieser Erkrankung unverstanden. Tiermodell vermochten es bisher auf Grund der interspezifischen Unterschiede der elektrophysiologischen Eigenschaften nicht diese zu beantworten. Kardiomyozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen haben sich im letzten Jahrzehnt zu einem vielversprechenden Werkzeug in der kardiovaskulären Forschung entwickelt. Ein auf iPSC-Kardiomyozyten atrialen Phänotyps basiertes Zellmodell könnte helfen diese Krankheit besser zu verstehen und damit den Weg für neue Behandlungsmöglichkeiten ebnen. Hierzu wurden iPSC-Kardiomyozyten mit Retinsäure behandelt um anschließend mit der Voltage-Clamp Methode den basalen einwärtsgleichgerichteten Kaliumstrom IK1 und den atrial spezifischen Acetylcholin aktivierten Strom IK,ACh zu untersuchen. Als Kontrolle dienten dabei iPSC-Kardiomyozyten ventrikulärer Differenzierung. In einem zweiten Schritt wurden diese atrialen iPSC-KMs im Rahmen von in-vitro Tachypacing Experimenten auf Veränderungen dieser Ströme untersucht und diese vor dem Hintergrund des atrialen Remodellings bei Vorhofflimmern beurteilt. Der durch ein rampenförmiges Spannungsprotokoll von -100 mV bis -40 mV hervorgerufene Barium-sensitive Basalstrom (IK1) zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Phänotypen. Dafür zeigte sich in den atrialen IPSC-KMs ein deutliche Stromzunahme durch Carbachol (2 µM; IK,ACh), während weniger als 10% der ventrikulären Zellen (3/32) eine Stromzunahme zeigten, was sich mit der 90% Reinheit des ventrikulären Phänotyps aus anderen Arbeiten deckt. In isolierten Zellen aus einem auf atrialen iPSC-Kardiomyozyten basierten Gewebemodell (EHM) zeigte sich, dass, sowohl IK1 als auch IK,ACh konserviert bleiben und in gleicher Weise in diesen Zellen exprimiert werden. Der konzentrationsabhängig durch Carbachol aktivierte IK,ACh zeigte den gleichen charakteristischen in humanen Kardiomyozyten beschriebenen Verlauf mit einem Peak- und einem QSS Strom und einer Abnahme der Stromzunahme bei wiederholter Aktivierung. Weiterhin konnte weder in der Anwesenheit des M-Rezeptor-Blockers Atropin (1 µM) noch in Anwesenheit des selektiven IK,ACh-Blockers Tertiapin (100nM) eine Stromzunahme durch Carbachol induziert werden, was zeigt, dass IK,ACh wie in humanem Gewebe über einen muskarinergen Acetylcholinrezeptor aktiviert und durch einen so genannten GIRK-Kanal vermittelt wird. Da der Basalstrom unter Tertiapin unverändert blieb kann ferner davon ausgegangen werden, dass dieser wie unter physiologischen Bedingungen nur von IK1 gebildet wird und dass es keine Rezeptor-unabhängige Aktivität von IK,ACh gibt. Neben Carbachol konnte wie in humanen atrialen Kardiomyozyten auch Adenosin (1 mM) konzentrationsabhängig eine Stromzunahme entsprechend IK,ACh induzieren (hier IK,Ado). Es konnte gezeigt werden, dass in-vitro Tachypacing mit 3 Hz im Vergleich zu einer 1 Hz – Kontrollgruppe suffizient ist, Veränderungen des IK,ACh zu induzieren. Während nach einem Stimulationszeitraum von 15 h noch keine signifikanten Veränderungen beobachtet werden konnten, so konnte nach 24 h eine schwache Tertiapin-sensitive Komponente des Basalstroms gemessen werden. Ein Wechsel des Zellmediums während der Stimulation mit einer Erhöhung des Calciumgehalts von 0,42 auf 1,8 mM führte schließlich zu einer signifikanten Reduktion sowohl von Peak- und QSS- IK,ACh sowie zu einer Tertiapin-sensitiven Komponente des Basalstroms von fast 30%. Obwohl für den absoluten Basalstrom bisher unter keiner der Stimulationsbedingungen eine signifikante Veränderung erzeugt werden konnte, so sprechen die beschriebenen Veränderungen von IK,ACh für ein potenziell Calcium-abhängiges Remodelling wie es in humanen Zellen von Patienten mit paroxysmalem oder chronischem Vorhofflimmern beschrieben wurde. Eine große Stärke der iPSC-Kardiomyozyten ist, dass sie im Gegensatz zu humanen Kardiomyozyten langfristig in Kultur gehalten werden können. So war es mit diesen Zellen möglich die Erholung vom Tachypacing zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die induzierten Veränderungen des IK,ACh potenziell reversibel sind, so dass das vorliegende Zellmodell geeignet scheint die zeitlichen Abläufe des Remodellings von VHF genauer zu untersuchen. Die Arbeit zeigt, dass aus humanen pluripotenten Stammzellen generierte Kardiomyozyten atrialen Phänotyps einen funktionellen, stabilen IK,ACh exprimieren und das in einer Größenordnung, die die Untersuchung und Induktion von Veränderungen des Stromes möglich macht. Mittels in-vitro Tachypacings konnte in iPSC-Kardiomyozyten das IK,ACh bezogene Remodelling des VHF repliziert werden und in einem nächsten Schritt wieder rückgängig gemacht werden. Hieraus ergibt sich ein vielversprechendes Zellmodell, welches in einem weiteren Schritt als Grundlage für ein auf iPSC-Kardiomyozyten basiertes Gewebemodell (EHM) dienen soll und damit die Untersuchung des Tachypacing-induzierten Remodellings unter Berücksichtigung der physiologischen Zell-Zell-Interaktion, sowie die Anwendung weiterer Untersuchungsmethoden und (pharmakologischen) Testungen möglich macht.
Schlagwörter: Vorhofflimmern; humane induzierte pluripotente Stammzellen; hiPSC-Kardiomyozyten; einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle; IK1; IK,ACh; Kardiologie; Pharmakologie; in-vitro Tachypacing
