Morphologische und mechanistische Analyse des Wachstums retinaler Ganglienzellen unter Einfluss von Mikrofluidik in vitro
The influence of microfluidics on retinal ganglion cell neurite outgrowth
by Celine Tater
Date of Examination:2025-04-23
Date of issue:2025-04-22
Advisor:PD Dr. Christian van Oterendorp
Referee:Prof. Dr. Carolin Wichmann
Referee:Prof. Dr. Margarete Schön
Sponsor:Promotionskolleg der Universitätsmedizin Göttingen (Jacob-Henle-Programm)
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11222
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Format:PDF
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Abstract
English
Replacing retinal ganglion cells (RGCs) in a degenerated optic nerve is not yet possible but may become feasible in the future through stem cell transplantation. Microfluidic fluid streams, presumably present in the optic nerve, are among the potential cues influencing the speed and direction of axon outgrowth toward its target. The largely unknown effect of microfluidics on RGC neurite outgrowth was studied. Primary cell cultures of postnatal rat RGCs and cortical neurons were used. Cells were grown for 48 hours inside flow chambers and exposed for 24 hours to different flow rates, inducing shear stress ranging from 10⁻⁷ to 10⁻³ dyn/cm². Cell density, length of the longest neurite, length of all but the longest neurite, number of neurites, and growth direction were assessed. The flow-to-non-flow ratio of each parameter was calculated and statistically tested with reference to the value 1 (no change). To inhibit mechanosensitive calcium channels, I-RTX (TRPV1), HC-067047 (TRPV4), or GsMTx4 (Piezo1 & 2) were added. BAPTA-AM was used as an intracellular calcium chelator. Lower shear stress (10⁻⁶ dyn/cm²) significantly increased the length of the longest neurite while inhibiting the length of all other neurites. Higher shear stress (10⁻³ dyn/cm²) caused significant degeneration, with reduced length of the longest neurite and decreased cell density. However, no change was observed in cortical neurons at either level of shear stress. Assuming the effects were mediated by mechanosensitive channels, the above-mentioned inhibitors were tested under both low and high shear stress conditions. The growth-promoting effect of low shear stress on the longest neurite was inhibited by all mechanosensitive channel inhibitors. The degenerative effects of higher shear stress on neurite length and cell density were significantly reduced by TRPV1 and TRPV4 inhibition, but not by Piezo1/2 inhibition, and showed a dose-dependent response to BAPTA-AM. In conclusion, RGCs appear to be highly sensitive to extracellular microfluidic flow. Lower shear stress promotes outgrowth of the presumed future axon while inhibiting elongation of future dendrites, whereas higher shear stress induces neurodegeneration. These effects may be mediated by mechanosensitive channels.
Keywords: retinal ganglion cells; microfluidics; shear stress; mechanosensitive channels; neurite outgrowth
German
Mittels Stammzelltransplantation könnten in Zukunft retinale Ganglienzellen (RGZ) in einem degenerierten Nervus opticus ersetzt werden. Hierbei könnte das auswachsende Axon extrazellulären Flüssigkeitsströmen ausgesetzt sein, deren Auswirkungen auf das Neuritenwachstum von RGZ bislang kaum untersucht sind. Primäre Kulturen von RGZ und – zum Vergleich – kortikaler Neurone wurden in Flusskammern für 24 Stunden verschiedenen Flussraten ausgesetzt, die als Scherkräfte (10⁻⁷ bis 10⁻³ dyn/cm²) auf die Zellen wirkten. Die Parameter Zelldichte, Länge des längsten Neuriten, Länge aller anderen Neuriten, Anzahl der Neuriten sowie die Wachstumsrichtung wurden ausgewertet. Die Flow/Non-Flow-Ratio wurde für jeden Parameter bestimmt und statistisch gegen den Wert 1 (keine Veränderung) getestet. Ebenso wurden die mechanosensitiven Calciumkanäle TRPV1 und TRPV4 sowie Piezo1/2 pharmakologisch inhibiert. Mittels BAPTA-AM wurde intrazelluläres Calcium gebunden. Die Länge des längsten Neuriten von RGZ wurde durch geringe, mikrofluidische Scherkräfte (10⁻⁶ dyn/cm²) signifikant gesteigert, sowie das Wachstum aller anderen außer des längsten Neuriten reduziert. Bei höheren Scherkräften (10⁻³ dyn/cm²) zeigte sich hingegen ein neurodegenerativer Effekt mit Verringerung der Länge des längsten Neuriten sowie der Zelldichte. Kortikale Neurone reagierten weder auf mikrofluidische noch auf erhöhte RGZ-degenerative Scherkräfte. Sowohl der neuritenwachstumssteigernde Effekt geringer Scherkräfte als auch der degenerative Effekt höherer Scherkräfte wurden durch die Inhibition mechanosensitiver Calciumkanäle an RGZ (vor allem TRPV1 und TRPV4, weniger oder nicht durch Piezo1/2-Inhibition) sowie dosisabhängig durch den Calciumchelator BAPTA-AM gehemmt. Zusammengefasst reagieren RGZ sensibel auf extrazelluläre Flüssigkeitsströme der getesteten Scherkraftstärken. Geringere Scherkräfte unterstützten das Auswachsen des späteren Axons und hemmten das Wachstum späterer Dendriten. Höhere Scherkräfte induzierten eine Neurodegeneration. Dieser Effekt wurde vermutlich über einen Calciumeinstrom durch mechansosensitive Calciumkanäle vermittelt und könnte für die Entwicklung von Stammzelltherapien relevant werden.
Schlagwörter: Retinale Ganglienzellen; Mikrofluidik; Scherkräfte; Mechanosensitive Kanäle; Neuritenwachstum
