FBRSL1 und seine Assoziation zum Polycomb-Komplex: Interaktionspartner und transkriptionaler Einfluss auf Zielgene

FBRSL1 and its association to the polycomb complex: interacting partners and transcriptional influence on genes

by Miriam Johanna Franken
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-05-13
Date of issue:2025-04-28
Advisor:Prof. Dr. Silke J. Pauli
Referee:Prof. Dr. Silke J. Pauli
Referee:PD Dr. Lars Schlotawa
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11199

 

 

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Description:Einladung Promotionsprüfung

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Abstract

English

Zusammenfassung Englisch At the University of Göttingen three children with similar congenital symptoms were genetically tested, and variants in the FBRSL1-Gene were found in all of them. During my thesis work, I tested this specific gene, which has different isoforms and is thought to be important for embryonal development. During testing, I focused on identifying possible interacting partners as well as the suspected regulatory influence of FBRSL1 on other genes. For parts of these studies, we also used samples from the three children with FBRSL1 variants. FBRSL1 is part of two Polycomb complexes, polycomb complex 1.3 and 1.5. It is already known that these polycomb complexes are essential for embryonal development, especially for mesodermal cells. For my testing on possible interacting partners, I used Western Blots and Yeast-Two-Hybrid experiments. I focused on ribosomal proteins, which had shown dysregulation during testing in an associated research group, as well as on proteins included in polycomb complex 1.3 and 1.5. The ribosomal proteins did not show any interaction with FBRSL1. The test results with the other proteins in the polycomb complex showed an interaction of PCGF3 (Polycomb Group RING Finger Protein 3) with FBRSL1. Additionally, there was an indirect interaction of CSNK2A1, a part of CK2 (Casein Kinase 2), with FBRSL1. Interestingly, we could prove that the interaction of FBRSL1 to CK2 was removed in two of the variants found in the children. Furthermore, I did qRT-PCRs (quantitative real-time polymerase chain reaction) to test for a possible influence of FBRSL1 on other gene expressions. A paralogue gene of FBRSL1, AUTS2, which can also be part of the polycomb complexes, is known to regulate the activity of these complexes. If AUTS2 is included in a complex, the genetic expression of different genes is changed. Now we examined the expression patterns of different genes in wild type FBRSL1 and in patients’ variants. We used genes which are known to be regulated by AUTS2. All of these genes showed a misregulation in two patients’ variants. In conclusion, they are likely influenced by FBRSL1. The third patient’s samples showed no difference in regulation of the genes, but the patient had been older when samples had been collected, which could be a possible explanation for that. We additionally found the regulation of the genes to be connected to age, as we found a difference in the qRT-PCRS in adult and children test samples. Further, one of the samples taken by a parent of the children with variants constantly showed different values than the others. All parents had beforehand been genetically tested and had shown no variants in FBRSL1. The variants found had therefore been classified as de novo variants. The dysregulation seen this time in the parent’s sample could be a sign of a low-level mosaic type in the parent’s cells. Additionally, I started establishing the first steps for a cell model in our research groups. This cell model could be used for future experiments, e.g. by using siRNA to suppress FBRSL1 in cells to save sample cells of the patients. For this cell model we used HeLA cells, and I was able to identify 24h as the best transfection time and Lipofectamine® as the best-tested transfection reagent.
Keywords: FBRSL1; Polycomb complex

German

Zusammenfassung Deutsch In der Universitätsmedizin in Göttingen wurden drei Kinder untersucht, die sehr ähnliche kongenitale Symptome aufwiesen, und bei denen in der genetischen Untersuchung Varianten im FBRSL1-Gen festgestellt wurden. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zu diesem Gen angestellt, das mehrere Isoformen besitzt und das vermutlich während der embryonalen Entwicklung eine große Rolle spielt. Bei diesen Versuchen lag der Fokus auf der Identifikation möglicher Interaktionspartner sowie auf Experimenten zu einem vermuteten regulatorischen Einfluss von FBRSL1 auf andere Gene. Hierzu wurden u.a. Proben der oben genannten Patienten mit FBRSL1-Varianten eingesetzt. FBRSL1 kann unter anderem als Teil zweier Polycomb-Komplexe, den Polycomb Komplexen 1.3 und 1.5., auftreten. Von diesen Polycomb-Komplexen ist bekannt, dass sie in der Embryonalentwicklung wichtige Einflüsse insbesondere auf mesodermale Zellen ausüben. Für die Versuche, die mögliche Interaktionspartner von FBRSL1 feststellen sollten, wurden Western-Blots und Yeast-Two-Hybrid-Experimente genutzt. Hierbei lag der Fokus auf ribosomalen Proteinen, die in Versuchen einer Partnerforschungsgruppe als fehlreguliert identifiziert worden waren, sowie auf Proteinen, die ebenfalls in den Polycomb-Komplexen 1.3. und 1.5 vorkommen. Die ribosomalen Proteine zeigten keinerlei Interaktion mit FBRSL1. Bei den Untersuchungen zu den Bestandteilen der Polycomb-Komplexe stellte sich heraus, dass PCGF3 (Polycomb Group RING Finger Protein 3) und die Untergruppe CSNK2A1 von CK2 (Casein Kinase 2) mit FBRSL1 interagieren, dies allerdings indirekt. Interessant war, dass die Interaktion von FBRSL1 mit CK2 beim Vorliegen zweier der bei den Kindern identifizierten Varianten aufgehoben wurde. Weiterhin wurden qRT-PCRs (quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction) durchgeführt, um einen möglichen Einfluss von FBRSL1 auf die Expression anderer Gene zu untersuchen. Von einem zu FBRSL1 paralogen Gen, AUTS2, ist dabei bekannt, dass es ebenfalls Bestandteil dieser Polycomb-Komplexe ist und unter anderem auch die Aktivität dieser Komplexe beeinflusst. Beim Vorliegen von AUTS2 in den Polycomb Komplexen verändern sich die Expressionen verschiedener Gene. Nun sollte das Expressionsmuster einiger Gene beim Vorliegen von Wildtyp-FBRSL1 und in den Patientenproben beim Vorliegen der Varianten untersucht werden. Ein erster Ansatz dieser Versuche konnte leider nicht gewertet werden, da sich die House Keeping Gene selbst als beeinflusst herausstellten. Für einen zweiten Versuchsansatz wurden dann Gene ausgewählt, die auch von AUTS2 beeinflusst werden. Alle diese Gene zeigten sich bei zwei der Proben mit den Varianten als fehlreguliert. Dementsprechend werden sie vermutlich durch FBRSL1 beeinflusst. Bei der dritten Probe hingegen zeigte sich diese Regulationsveränderung nicht, hier war der Patient bei der Probenentnahme allerdings auch etwas älter, was ein Erklärungsansatz hierfür sein könnte. Hierzu passend zeigte sich der Regulationseinfluss auch als altersabhängig, da sich Unterschiede bei den qRT-PCRs zwischen Kindern und Erwachsenen zeigten. Des Weiteren fiel eine der mituntersuchten Proben der Eltern als auffällig und konstant von den anderen Proben abweichend auf. Alle Eltern waren in genetischen Untersuchungen als unauffällig hinsichtlich der beim Kind identifizierten Variante getestet worden und somit die FBRSL1-Varianten bei den Kindern als de novo klassifiziert worden. Diese Abweichung in der Regulierung könnte ein Hinweis auf ein niedriggradiges Mosaik bei diesem Elternteil sein. Des Weiteren wurden erste Schritte zur Etablierung eines Zellmodells unternommen. Dieses Zellmodell könnte für zukünftige Experimente genutzt werden, indem mittels siRNA FBRSL1 herunterreguliert und so Probenmaterial eingespart wird. Für dieses Zellmodell wurden als beste Zellreihe HeLa-Zellen, als bester Transfektionsabstand 24h und als bestes Transfektionsreagenz Lipofectamine® etabliert.
Schlagwörter: FBRSL1; Polycomb-Komplex