Das Potenzial spezifischer methylierter DNA im Blut als Biomarker für die Mortalität bei Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion

The potential of specific methylated DNA in blood as a biomarker for mortality in heart failure with preserved ejection fraction

by Giulia-Assunta Candela
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-05-21
Date of issue:2025-05-07
Advisor:Prof. Dr. Elisabeth Zeisberg
Referee:Prof. Dr. Elisabeth Zeisberg
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Sponsor:Jacob-Henle-Programm der Universitätsmedizin Göttingen
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11247

 

 

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Format:PDF
Description:Dissertation

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Abstract

English

Chronic heart failure is a leading health risk worldwide for the increasingly ageing population. Patients with heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) account for around half of all cases. Making a valid statement regarding the individual prognosis of HFpEF patients and identifying those with a higher mortality risk is a current challenge for which suitable markers still need to be found. In order to discover biomarkers for risk assessment, epigenetic changes, such as methylation patterns, are increasingly being investigated. In this study, the promoter methylation of ACAP3, CHRD, GADD45G, IRX3 and TCF21 was also determined using DNA isolated from blood and associations with clinical parameters and mortality were presented in order to assess their potential as possible biomarkers. The use of circulating DNA represents a non-invasive alternative to cardiac biopsies. To determine the promoter methylation of TCF21, primers corresponding to differentially methylated promoter regions were created (the primers for the other genes were already available). For this purpose, the gene was isolated from cardiomyopathy biopsies and a healthy control sample, processed using bisulphite conversion, proliferated by transformation into bacteria and analyzed for methylation differences in the various samples by sequencing. The primers were developed on the basis of these areas. The DNA required in the following was isolated from the blood of 47 patients from an HFpEF cohort and the methylated regions were filtered out by immunoprecipitation. Quantitative real-time PCR was used to determine the methylation status. No CHRD methylation values were detected in any of the samples. For the statistical analysis of the remaining genes, the methylation values were divided into two groups based on the median and compared. In addition, correlation analyses were carried out. While for ACAP3 the focus was on renal associations that cannot be clearly explained by the literature, associations with cardiac parameters were found for GADD45G, which underline the findings of a heart failure-promoting function of GADD45G. In IRX3, methylation was associated with atrial fibrillation (AF) and previous myocardial infarction (MI). These results confirm previous studies that described lower methylation with a worse outcome of cardiac patients. In addition, VHF and MI have already been associated with the development and occurrence of HFpEF. What function IRX3 has in this context and whether IRX3 could be used as a marker indicating HFpEF or prognosis would need to be investigated further for more precise conclusions. TCF21 proved to be a particularly interesting gene due to significant associations with numerous parameters. Overall, increased promoter methylation indicated apparently more favorable patient parameters. Therefore, the assignment of TCF21 to different HFpEF subtypes would also be of interest to find out whether methylation can possibly say something about the (cardiac) condition and clinical picture of HFpEF patients. In order to interpret the observations of this study in the context of previous results, which tend to attribute a cardioprotective effect to TCF21, and to explain the apparent contradiction, TCF21 should be further investigated at the molecular level. For TCF21, methylation in an aortic stenosis (AS) cohort should also be investigated. The blood samples of 85 AS patients who had undergone transcatheter aortic valve implantation were used for this purpose. The statistical analysis of these data revealed no significant associations, which means that the results and indications found in the HFpEF cohort could not be transferred to this cohort. In the univariate and multivariate survival time analyses, no significant influence on survival was found for any of the genes. Accordingly, the results do not indicate a benefit as a potential mortality marker in HFpEF or AS. On the other hand, BMI as a known prognostic factor proved to be superior in determining mortality risk. Finding new potential mortality markers thus continues to be an important aspect of HFpEF research. This work has shown that GADD45G, IRX3 and especially TCF21 are interesting genes in cardiovascular research and that their occurrence and correlations to clinical images should be further investigated in order to assess and interpret the associations found here. In addition, the interest of epigenetic changes in cardiovascular research was also confirmed.
Keywords: HFpEF; heart failure; heart failure with preserved ejection fraction; epigenetics; biomarker; methylation; cfDNA; ACAP3; Chordin; GADD45G; IRX3; SCNN1D; TCF21

German

Die chronische Herzinsuffizienz stellt weltweit ein führendes gesundheitliches Risiko der zunehmend älter werdenden Bevölkerung dar. Etwa die Hälfte der Fälle geht auf Patienten mit einer Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) zurück. Eine valide Aussage bezüglich der individuellen Prognose von HFpEF-Patienten zu treffen und die Personen mit einem höheren Mortalitätsrisiko zu identifizieren, ist eine gegenwärtige Herausforderung, für deren Bewältigung noch geeignete Marker gefunden werden müssen. Um Biomarker zur Risikoeinschätzung zu entdecken, werden vermehrt epigenetische Veränderungen, wie z. B. Methylierungsmuster untersucht. Auch in dieser Arbeit wurde die Promotormethylierung von ACAP3, CHRD, GADD45G, IRX3 und TCF21 anhand aus dem Blut isolierter DNA bestimmt und Assoziationen zu klinischen Parametern und der Mortalität dargestellt, um ihr Potenzial als mögliche Biomarker einschätzen zu können. Die Nutzung zirkulierender DNA stellt hierbei eine nicht-invasive Alternative zu kardialen Biopsien dar. Zur Bestimmung der Promotormethylierung von TCF21 wurden Primer entsprechend differenziell methylierter Promotorregionen gebildet (die Primer für die anderen Gene lagen bereits vor). Hierzu wurde das Gen aus Kardiomyopathie-Biopsien und einer gesunden Kontrollprobe isoliert, mithilfe einer Bisulfit-Konversion bearbeitet, mittels Transformation in Bakterien proliferiert und anhand einer Sequenzierung auf Methylierungsunterschiede in den verschiedenen Proben untersucht. Auf Grundlage dieser Bereiche wurden die Primer entwickelt. Die im Folgendem benötigte DNA wurde aus dem Blut von 47 Patienten einer HFpEF-Kohorte isoliert und die methylierten Bereiche wurden durch Immunpräzipitation herausgefiltert. Mithilfe der quantitativen Echtzeit-PCR konnte der Methylierungsstatus ermittelt werden. Bei keiner Probe ließen sich hierbei Werte für die CHRD-Methylierung feststellen. Zur statistischen Analyse der restlichen Gene wurden die Methylierungswerte jeweils anhand des Medians in zwei Gruppen geteilt und verglichen. Darüber hinaus wurden Korrelationsanalysen durchgeführt. Während bei ACAP3 v.a. renale Assoziationen im Vordergrund standen, die mit der Literatur nicht eindeutig erklärt werden können, wurden für GADD45G Assoziationen mit kardialen Parametern gefunden, die Erkenntnisse zu einer Herzinsuffizienz-fördernden Funktion von GADD45G unterstreichen. Bei IRX3 konnte die Methylierung mit Vorhofflimmern (VHF) und vorausgegangenen Myokardinfarkten (MI) in Verbindung gebracht werden. Diese Ergebnisse bestärken vorherige Arbeiten, die eine geringere Methylierung mit einem schlechteren outcome kardial erkrankter Patienten beschrieben. Zudem konnten VHF und MI bereits mit der Entstehung und dem Auftreten von HFpEF in Verbindung gebracht werden. Welche Funktion IRX3 in diesem Kontext hat und ob IRX3 somit ggf. als Marker, der auf eine HFpEF oder auf die Prognose hinweist, genutzt werden könnte, müsste für genauere Aussagen weiter untersucht werden. TCF21 hat sich durch signifikante Assoziationen mit zahlreichen Parametern als besonders interessantes Gen herausgestellt. Insgesamt wies eine gesteigerte Promotormethylierung auf scheinbar vorteilhaftere Parameter der Patienten hin. Daher wäre auch die Zuordnung von TCF21 zu verschiedenen HFpEF-Subtypen von Interessen, um herauszufinden, ob die Methylierung ggf. etwas über den (kardialen) Zustand und das klinische Bild von HFpEF- Patienten aussagen kann. Um die Beobachtungen dieser Arbeit im Kontext vorheriger Ergebnisse, die TCF21 eher eine kardioprotektive Wirkung zuordnen, interpretieren und den scheinbaren Gegensatz erklären zu können, sollte TCF21 auf molekularer Ebene weiter erforscht werden. Für TCF21 sollte zusätzlich die Methylierung in einer Aortenstenose(AS)-Kohorte untersucht werden. Hierzu wurden die Blutproben von 85 AS-Patienten, bei denen eine Transkatheter- Aortenklappen-Implantation durchgeführt wurde, genutzt. Die statistische Analyse dieser Daten ergab keine signifikanten Assoziationen, wodurch sich die gefundenen Ergebnisse und Hinweise der HFpEF-Kohorte nicht auf diese Kohorte übertragen ließen. Im Rahmen der uni- und multivariaten Überlebenszeitanalysen konnte für keines der Gene ein signifikanter Einfluss auf das Überleben festgestellt werden. Die Ergebnisse lassen demnach nicht auf einen Nutzen als potenzielle Mortalitätsmarker bei HFpEF bzw. bei AS schließen. Dahingegend zeigte sich der BMI als bekannter prognostischer Faktor überlegen in der Ermittlung des Mortalitätsrisikos. Das Finden neuer potenzieller Mortalitätsmarker stellt somit weiterhin einen wichtigen Aspekt der HFpEF-Forschung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass GADD45G, IRX3 und besonders TCF21 interessante Gene der kardiovaskulären Forschung darstellen und ihr Vorkommen und die Zusammenhänge zu klinischen Bildern weiter untersucht werden sollten, um die hier gefunden Assoziationen einschätzen und interpretieren zu können. Zudem konnte auch das Interesse epigenetischer Veränderungen in der kardiovaskulären Forschung bestätigt werden.
Schlagwörter: HFpEF; Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion; Herzinsuffizienz; Epigenetik; Biomarker; Methylierung; cfDNA; ACAP3; Chordin; GADD45G; IRX3; SCNN1D; TCF21