SHISA3, a novel Wnt-dependent Signature in the Developing and Failing Heart
by Laura Priesmeier
Date of Examination:2024-09-17
Date of issue:2025-05-27
Advisor:Prof. Dr. Laura Zelarayán-Behrend
Referee:Prof. Dr. Katrin Streckfuß-Bömeke
Referee:Prof. Dr. Ralf Dressel
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11245
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Format:PDF
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Abstract
English
Understanding how vascular cells develop can be used to discover new paths of cell renewal within the diseased heart, with a particular focus on the epicardium for cardiac regeneration. Previous studies have shown that activating the Wnt/β-catenin pathway leads to the reprogramming of cardiomyocytes and vascular cells, resulting in harmful changes in the adult heart. In this study, a previously unknown population of SHISA3-expressing cells, distinct from cardiomyocytes, was discovered in both developing and diseased hearts. I aimed to investigate the role of these cells in determining the fate of human vascular cells derived from sub-epicardial cardiovascular progenitors using human induced pluripotent stem cell (hiPSC) derived in vitro models. In mouse embryos at day 14.5, SHISA3+ cells expressing alpha smooth muscle actin were predominantly found in the sub-epicardium, aligning with the presence of immature vascular markers. Consistent with previously described in vivo findings, early upregulation of SHISA3 along with a gradual decline was displayed in hiPSCs differentiated towards epicardial cells (EPI cells) and their vascular smooth muscle cell (vSMC) and fibroblast derivatives. To further confirm the SHISA3+ population as a shared pool of early vascular progenitors, whole cell single cell sequencing of these cells was conducted at differentiation day 8. This analysis unveiled SHISA3 as a marker gene exclusively expressed in early transitional cells, undergoing an epicardial-to-mesenchymal shift in cell identity. To understand the impact of SHISA3 overexpression on these models in a precisely controlled manner, I created and analyzed transgenic hiPSC lines. Using the CRISPRa technology coupled with a doxycycline inducible guide RNA, these lines allowed for inducible endogenous SHISA3 activation, whereas a non-targeting guide RNA served as control. Originating from an epicardial state, SHISA3-acitvated cells were directed towards vSMCs with subsequent whole transcriptome RNA analysis. Here, notable effects on the regulation of TGFβ as well as p53 signaling pathways were revealed. Given that these pathways play fundamental roles in the epithelial-to- mesenchymal transition (EMT) process, this characterizes SHISA3 as a potential key regulator of vascular cell development from the epicardium. Furthermore, evidence for a SHISA3- and TGFβ-mediated mutual control mechanism was found in EPI cells treated with TGFβ-inhibitors, leading to sustained expression of SHISA3 throughout development. These findings characterized SHISA3 as an exclusive marker of early epicardium-derived transitional progenitor cells, influencing cardiovascular cell fate determination in development and, potentially, compensatory fetal reprogramming in the diseased heart. Increased expression of SHISA3 during the early development of vSMCs from the described innovative SHISA3 gene activator hiPSC line indicated a SHISA3-dependent regulation of critical pathways involved in EMT. This underscores a significant role for SHISA3 in determining cell fate during epicardial EMT-driven vascular cell development.
Keywords: Epicardium; Epithelial-to-mesenchymal transition; Vascular remodeling; Intercellular crosstalk; Neovasculogenesis
German
Die Mechanismen der Entwicklung vaskulärer Zellen während der Kardiogenese können genutzt werden, um neue Wege der kardialen Regeneration im erkrankten Herzen zu entdecken, mit besonderem Fokus auf dem Epikard als therapeutisches Target. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zur Reprogrammierung von Kardiomyozyten und vaskulären Zellen führt, was im erwachsenen Herzen ein progredientes pathologisches Umbauprogramm zur Folge hat. In dieser Studie wurde eine bislang unbekannte Population von SHISA3-exprimierenden Zellen mit kardiovaskulärem Progenitor-Potential untersucht, die eine Re-Expression von SHISA3 im erkrankten Herzen aufwiesen. In Maus-Embryonen wurden SHISA3-positive Zellen, die frühe vaskuläre Markergene exprimieren, zum Zeitpunkt E 14.5 vorwiegend im Subepikard gefunden. Ziel meiner Arbeit war es, die Rolle von SHISA3 im Differenzierungsweg humaner mesenchymaler Zellen zu untersuchen, die aus subepikardialen kardiovaskulären Vorläuferzellen stammen. In Übereinstimmung mit zuvor beschriebenen in vivo-Ergebnissen zeigte sich in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), die zu epikardialen Zellen (EPI-Zellen) und deren Abkömmlingen, den glatten Gefäßmuskelzellen (vSMCs) und Fibroblasten, differenziert wurden, eine frühe Hochregulation von SHISA3, verbunden mit einem darauffolgenden kontinuierlichen Rückgang an SHISA3-Expression. Um die SHISA3-positive Population als gemeinsamen Pool früher vaskulärer Vorläuferzellen weiter zu analysieren, wurde eine Single-Cell RNA-Sequenzierung dieser Zellen am Tag 8 der Differenzierung durchgeführt. Diese Analyse identifizierte SHISA3 als Marker-Gen, das ausschließlich in frühen Übergangszellen exprimiert wird, die sich im Prozess eines epikardial-mesenchymalen Identitätswechsels befinden. Um die Auswirkungen einer SHISA3-Überexpression in diesen Modellen präzise untersuchen zu können, wurden transgene hiPSC-Linien generiert und charakterisiert. Mithilfe der CRISPRa-Technologie in Kombination mit einer Doxyzyklin-induzierbaren guide RNA war in diesen Linien eine kontrollierte endogene Aktivierung von SHISA3 möglich, während eine nicht-zielgerichtete guide RNA als Kontrolle diente. Ausgehend von einer epikardialen Population wurden mittels Doxycyclin SHISA3-aktivierte Zellen zu vSMCs differenziert, gefolgt von einer RNA-Gesamttranskriptomanalyse. Dabei zeigten sich signifikante Effekte auf die Regulation der TGFβ- sowie der p53-Signalwege. Da diese Signalwege eine zentrale Rolle in der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) spielen, charakterisiert dies SHISA3 als potenziellen Schlüsselregulator der vaskulären Zellentwicklung aus dem Epikard. Darüber hinaus wurden Hinweise auf einen wechselseitigen Kontrollmechanismus zwischen SHISA3 und TGFβ in EPI-Zellen gefunden, die mit TGFβ-Inhibitoren behandelt wurden: Dies führte zu einer anhaltenden Expression von SHISA3 während der Entwicklung. Diese Ergebnisse charakterisieren SHISA3 als exklusiven Marker unreifer, vom Epikard abgeleiteter Vorläuferzellen, der die Festlegung des kardiovaskulären Differenzierungswegs in der Entwicklung und möglicherweise auch bei kompensatorischer fetaler Reprogrammierung im erkrankten Herzen beeinflusst. Die erhöhte Expression von SHISA3 während der frühen Entwicklung von vSMCs aus der beschriebenen SHISA3-Genaktivator-hiPSC-Linie deutet auf eine SHISA3-abhängige Regulation kritischer, an der EMT beteiligter Signalwege hin. Dies unterstreicht die bedeutende Rolle von SHISA3 bei der mesenchymalen Identätsfindung während der durch das Epikard vermittelten, EMT-getriebenen Entwicklung vaskulärer Zellen.
Schlagwörter: Epicardium; Epithelial-to-mesenchymal transition; Vascular remodeling; Intercellular crosstalk; Neovasculogenesis
