Im Blut zirkulierende methylierte DNA-Fragmente der Gene ATP2A2, B9D1 und RASAL1 als Biomarker für die Erkrankungen Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) und Aortenklappenstenose
Circulating Methylated DNA Fragments of the Genes ATP2A2, B9D1 and RASAL1 in Blood as Biomarkers for Heart Failure with Preserved Ejection Fraction (HFpEF) and Aortic Stenosis
by Freia Gottfried
Date of Examination:2025-08-13
Date of issue:2025-07-31
Advisor:Prof. Dr. Elisabeth Zeisberg
Referee:Prof. Dr. Elisabeth Zeisberg
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11417
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Name:Dissertation Freia Gottfried 2025.pdf
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Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract
English
Both patients with HFpEF and those with aortic stenosis generally have a high mortality and a poor prognosis. With the currently available clinically established biomarkers, it is not possible to sufficiently identify high-risk patients or adequately predict the individual progression of the disease, resulting in a persistently poor prognosis for both conditions. The prevalence of HFpEF and aortic stenosis shows an age-dependent shift, with a particularly high prevalence among elderly patients, suggesting that the relevance of these diseases will likely increase in the context of an aging global population. Both diseases share the pathomechanistic significance of cardiac fibrosis, which also has prognostic relevance. DNA methylation is considered one of the main mechanisms of epigenetic modification of human DNA. Aberrant promoter methylation of specific genes has been shown to causally influence pathological fibrogenesis in the heart. In accordance with the principle of liquid biopsy, previous studies have demonstrated a correlation between the aberrant promoter methylation of specific genes measured in the blood and the promoter methylation of these genes measured in heart tissue. These findings, rooted in the principle of liquid biopsy, indicate the potential suitability of aberrant promoter methylation of specific genes in the blood as a biomarker for cardiac diseases sharing the pathomechanistic feature of cardiac fibrosis. Due to a lack of myocardial biopsies, mortality served as a correlate for cardiac fibrosis and disease progression in the present study. A preliminary study by the Zeisberg research group has already provided indications for the suitability of aberrant promoter methylation of the three genes ATP2A2, B9D1 and RASAL1 measured in blood as prognostic biomarkers for patients with HFpEF. Another preliminary study by the Zeisberg research group found indications of the suitability of aberrant promoter methylation of specific genes in the blood as prognostic biomarkers for aortic stenosis. The aim of the present study was to investigate, in accordance with the principle of liquid biopsy, whether aberrant promoter methylation of the three genes ATP2A2, B9D1 and RASAL1 in blood is suitable as a biomarker for clinical progression and for risk stratification of patients with HFpEF or aortic stenosis who share the pathomechanistic feature of cardiac fibrosis. Furthermore, the study aimed to determine whether measuring the aberrant promoter methylation of these three genes in the blood offers advantages over the measurement of other clinical parameters. Blood samples and various clinical parameters were analyzed from patients in three cohorts. The DIAST and HFpEF cohorts were used to study the underlying disease HFpEF. The TAVI cohort was used to investigate the underlying disease aortic stenosis. To measure the aberrant promoter methylation of the three genes ATP2A2, B9D1 and RASAL1, the DNA was first isolated from blood samples and subsequently purified. In the following step methylated DNA was separated using antibody-mediated MeDIP. Finally, the proportion of promoter methylation of the three genes was determined by qRT-PCR. Following a general characterization of the studied cohorts, the investigation initially focused on correlations between the promoter methylation of the three genes in blood and clinical parameters. Only the promoter methylation of the B9D1 gene correlated significantly with the already established cardiac biomarker BNP. Higher B9D1 promoter methylation in the blood was associated with higher levels of BNP in the blood. This result can be interpreted as an indication that the B9D1 gene plays a role in the heart and that aberrant B9D1 promoter methylation, like BNP, reflects cardiac pathology. Higher levels of BNP in the blood are generally associated with increased cardiac pathology. Aberrant promoter methylation typically leads to reduced gene expression. Taken together, the results of the present study therefore suggest a protective gene function of the B9D1 gene in the heart, which is lost in the context of cardiac pathologies due to aberrant promoter methylation of the B9D1 gene. For all other clinical parameters, no significant correlation was found with the promoter methylation of the three genes examined in the blood. This overall lack of correlation can be taken as an indication that measuring promoter methylation in the blood is superior to measuring other clinical parameters, including already established biomarkers, and may offer added value. In the second part of this study, the potential use of aberrant promoter methylation of the three genes ATP2A2, B9D1 and RASAL1 in the blood as a prognostic biomarker for the diseases HFpEF and aortic stenosis was evaluated. In survival models based on the DIAST cohort, aberrant promoter methylation of the three genes in the blood showed a significant influence on the overall survival of patients with the underlying disease HFpEF. These survival models were applied to the HFpEF and TAVI cohorts in the form of Cox regressions. ATP2A2 promoter methylation in the blood could not be validated as a prognostic biomarker for either of the two diseases. Using the data set of the TAVI cohort to study the disease aortic stenosis, it was also not possible to validate the promoter methylation of the three genes in the blood as a prognostic biomarker. In contrast, the data set of the HFpEF cohort provided indications of the suitability of promoter methylation of the genes B9D1 and RASAL1 in the blood as prognostic biomarkers for patients with the underlying disease HFpEF. The lack of correlation between aberrant promoter methylation of the three genes in the blood and clinical parameters, as highlighted in the first part of the study, can be interpreted in conjunction with the results of the second part of this study as a sign of the specificity and independence and thus the added value of the promoter methylation of the genes B9D1 and RASAL1 in the blood as new potential prognostic biomarkers. In summary, this study confirmed that promoter methylation of the two genes B9D1 and RASAL1 in blood could represent a potential prognostic biomarker for HFpEF, demonstrating added value over the measurement of other clinical parameters. Based on these findings, there is evidence to suggest that aberrant promoter methylation of specific genes in blood could represent a suitable biomarker for cardiac diseases sharing the pathomechanistic feature of cardiac fibrosis. Further studies are warranted to validate these findings.
Keywords: cardiology; heart failure; heart failure with preserved ejection fraction; HFpEF; aortic stenosis; cardiac fibrosis; biomarker; liquid biopsy; cfDNA; epigenetics; DNA methylation; ATP2A2; B9D1; RASAL1
German
Sowohl Patienten mit HFpEF als auch Patienten mit Aortenklappenstenose weisen im Allgemeinen eine hohe Mortalität und schlechte Prognose auf. Mit den aktuell zur Verfügung stehenden klinisch etablierten Biomarkern gelingt keine ausreichende Identifikation von Hochrisikopatienten und keine ausreichende Prognostizierung des individuellen Krankheitsprogresses, sodass für beide Erkrankungen weiterhin eine schlechte Prognose besteht. Die Prävalenz der Erkrankungen HFpEF und Aortenklappenstenose zeigt eine altersabhängige Verschiebung, im Sinne einer hohen Prävalenz insbesondere bei älteren Patienten, sodass die Relevanz der Erkrankungen in der weltweit alternden Gesellschaft voraussichtlich zunehmen wird. Beide Erkrankungen teilen sich die pathomechanistische Bedeutung der Herzfibrose, die zudem eine prognostische Relevanz zeigt. Die DNA-Methylierung gilt als einer der Hauptmechanismen der epigenetischen Modifikation menschlicher DNA. Die aberrante Promotormethylierung spezifischer Gene zeigt einen kausalen Einfluss auf die pathologische Fibrogenese im Herzen. In Vorarbeiten ergab sich, entsprechend des Prinzips der Liquid Biopsy, eine Korrelation der im Blut gemessenen aberranten Promotormethylierung spezifischer Gene mit der im Herzgewebe gemessenen Promotormethylierung dieser Gene. Anhand des Prinzips der Liquid Biopsy ergeben sich damit Hinweise auf die Eignung der aberranten Promotormethylierung spezifischer Gene im Blut als Biomarker für kardiale Erkrankung mit pathomechanistischer Gemeinsamkeit der Herzfibrose. Aufgrund eines Mangels an Myokardbiopsien diente in der vorliegenden Arbeit die Mortalität als Korrelat für Herzfibrose und den Erkrankungsprogress. Eine Vorarbeit der Arbeitsgruppe Zeisberg ergab bereits Hinweise auf die Eignung der im Blut gemessenen aberranten Promotormethylierung der drei Gene ATP2A2, B9D1 und RASAL1 als prognostische Biomarker für Patienten mit der Erkrankung HFpEF. Auch für das Krankheitsbild Aortenklappenstenose konnte eine Vorarbeit der Arbeitsgruppe Zeisberg Hinweise auf die Eignung der aberranten Promotormethylierung spezifischer Gene im Blut als prognostischen Biomarker finden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand des Prinzips der Liquid Biopsy zu untersuchen, ob sich die aberrante Promotormethylierung der drei Gene ATP2A2, B9D1 und RASAL1 im Blut als Biomarker für die klinische Progression und zur Risikostratifizierung von Patienten mit HFpEF bzw. Aortenklappenstenose eignet, die sich die pathomechanistische Gemeinsamkeit der Herzfibrose teilen. Zudem sollte überprüft werden, ob die Messung der aberranten Promotormethylierung der drei Gene im Blut Vorteile gegenüber der Erfassung anderer klinischer Parameter bietet. Es wurden Blutproben und verschiedene klinische Parameter von Patienten aus drei Kohorten analysiert. Die DIAST- und HFpEF-Kohorte dienten der Betrachtung der Grunderkrankung HFpEF. Die TAVI-Kohorte diente der Betrachtung der Grunderkrankung Aortenklappenstenose. Zur Messung der aberranten Promotormethylierung der drei Gene ATP2A2, B9D1 und RASAL1 wurde die DNA zunächst aus Blutproben isoliert und aufgereinigt. Die methylierte DNA konnte anschließend antikörpervermittelt per MeDIP separiert werden. Der Anteil der Promotormethylierung der drei Gene wurde daraufhin per qRT-PCR ermittelt. Nach einer allgemeinen Charakterisierung der untersuchten Kohorten folgte zunächst die Untersuchung von Zusammenhängen der Promotormethylierung der drei Gene im Blut mit klinischen Parametern. Einzig die Promotormethylierung des Gens B9D1 korrelierte hierbei signifikant mit dem bereits etablierten kardialen Biomarker BNP. Eine höhere B9D1-Promotormethylierung im Blut ging mit höheren Werten von BNP im Blut einher. Dieses Ergebnis kann als Hinweis darauf verstanden werden, dass das Gen B9D1 eine Rolle am Herzen spielt und die aberrante B9D1-Promotormethylierung wie BNP eine kardiale Pathologie widerspiegelt. Höhere Werte von BNP im Blut gehen im Allgemeinen mit einer verstärkten kardialen Pathologie einher. Eine aberrante Promotormethylierung führt in der Regel zu einer verminderten Genexpression. In Zusammenschau lassen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit daher eine protektive Genfunktion des Gens B9D1 am Herzen vermuten, die im Rahmen kardialer Pathologien durch eine aberrante Promotormethylierung des Gens B9D1 verloren geht. Für alle weiteren klinischen Parameter ergab sich keine signifikante Korrelation mit der Promotormethylierung der drei untersuchten Gene im Blut. Diese insgesamt fehlende Korrelation kann als Hinweis darauf verstanden werden, dass die Messung der Promotormethylierung im Blut der Erfassung anderer klinischer Parameter, einschließlich bereits etablierter Biomarker, überlegen ist und einen Mehrwert bieten kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Möglichkeit zur Nutzung der aberranten Promotormethylierung der drei Gene ATP2A2, B9D1 und RASAL1 im Blut als prognostischer Biomarker für die Krankheitsbilder HFpEF und Aortenklappenstenose evaluiert. In Überlebensmodellen an der DIAST-Kohorte zeigte die aberrante Promotormethylierung der drei Gene im Blut einen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten mit der Grunderkrankung HFpEF. Diese Überlebensmodelle wurden in Form von Cox-Regressionen auf die HFpEF- und TAVI-Kohorte übertragen. Die ATP2A2-Promotormethylierung im Blut konnte für beide Krankheitsbilder nicht als prognostischer Biomarker validiert werden. Am Datensatz der TAVI-Kohorte zur Untersuchung des Krankheitsbildes Aortenklappenstenose gelang ebenfalls keine Validierung der Promotormethylierung der drei Gene im Blut als prognostischer Biomarker. Am Datensatz der HFpEF-Kohorte ergaben sich dagegen Hinweise auf die Eignung der Promotormethylierung der Gene B9D1 und RASAL1 im Blut als prognostische Biomarker für Patienten mit der Grunderkrankung HFpEF. Die im ersten Teil der Arbeit herausgestellte fehlende Korrelation der aberranten Promotormethylierung der drei Gene im Blut mit klinischen Parametern kann in Zusammenschau mit den Ergebnissen des zweiten Teils dieser Arbeit als Zeichen der Spezifität und Unabhängigkeit und damit des Mehrwertes der neuen potentiellen prognostischen Biomarker B9D1- und RASAL1-Promotormethylierung im Blut interpretiert werden. Resümierend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Promotormethylierung der zwei Gene B9D1 und RASAL1 im Blut als potentieller prognostischer Biomarker für die Erkrankung HFpEF bestätigt und der Mehrwert hinsichtlich der Erhebung anderer klinischer Parameter herausgestellt werden. Es ergeben sich damit anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Hinweise auf die Eignung der aberranten Promotormethylierung spezifischer Gene im Blut für kardiale Erkrankungen, die sich die pathomechanistische Gemeinsamkeit der Herzfibrose teilen. Hier müssen sich Folgestudien anschließen.
Schlagwörter: Kardiologie; Herzinsuffizienz; Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion; HFpEF; Aortenklappenstenose; Herzfibrose; Biomarker; Liquid Biopsy; zirkulierende zellfreie DNA; Epigenetik; DNA-Methylierung; ATP2A2; B9D1; RASAL1
