Untersuchungen zur Expression, subzellulären Lokalisation und Sekretion der Ribonuklease T2 im Mausmodell

Studies on the Expression, Subcellular Localisation, and Secretion of Ribonuclease T2 in Mice

by Pascal Götz
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-09-22
Date of issue:2025-07-31
Advisor:Prof. Dr. Jutta Gärtner
Referee:Prof. Dr. Jutta Gärtner
Referee:PD Dr. Niklas Engels
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11403

 

 

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Format:PDF
Description:Dissertation

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Abstract

English

Loss-of-function mutations in the human RNASET2 gene are associated with an early-onset cystic leukoencephalopathy, which typically manifests as a disorder resembling congenital cytomegalovirus infection. This rare autosomal recessive condition has been classified as a type I interferonopathy. It is characterised by developmental delays, along with the potential emergence of severe neurological symptoms such as ataxia, spasticity, epilepsy, and sensorineural hearing loss. The biological function of ribonuclease T2 (RNase T2) remains inadequately understood. Additionally, the existing literature presents conflicting perspectives on the subcellular localisation and potential secretion of RNase T2. This study aimed to elucidate the subcellular localisation of RNase T2 and to demonstrate its secretion in mice. Expression analyses of RNase T2 were conducted in embryonic immortalised mouse fibroblasts (iMEFs) and murine tissues. The expression of Rnaset2 in iMEFs was assessed using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), which revealed low endogenous expression that was further confirmed by Western blot analysis. To evaluate RNase T2 expression in murine tissue sections, an indirect approach was taken using immunohistochemical staining of β-galactosidase, achieved by substituting Rnaset2 with a reporter gene in the mouse model. This method successfully demonstrated RNase T2 expression in hepatocytes, cardiomyocytes, tubular epithelial cells, megakaryocytes, and hematopoietic cells. The subcellular localisation of RNase T2 in iMEFs was analysed using a tagged RNase T2 construct through immunofluorescence and high-resolution spinning disk confocal microscopy. RNase T2 was found to be predominantly localised within the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, early endosomes and exosomes. Based on these findings, it is presumed that RNase T2 is secreted via an exosome-mediated pathway. Consequently, the processes of secretion and endocytosis of RNase T2 were further investigated using Western blot analysis of a tagged RNase T2 construct in iMEFs. The presence of RNase T2 in cell culture supernatants confirmed its secretion. However, this study did not experimentally validate the endocytosis of RNase T2. These findings significantly enhance the understanding of the potential RNase T2 functions and clarify its role in immune regulation. This work provides a foundation for further experimental investigations and the development of potential therapeutic strategies.
Keywords: RNase T2; RNASET2; leukoencephalopathy; interferonopathy; ribonuclease T2; secrection; localisation; expression

German

Loss-of-function Mutationen im RNASET2 Gen führen innerhalb des ersten Lebensjahres zu einer genetischen zystischen Leukenzephalopathie, die phänotypisch eine kongenitale Infektion mit dem Zytomegalievirus imitiert. Kinder mit dieser seltenen autosomal-rezessiven Erkrankung, die als Typ-I-Interferonopathie klassifiziert wurde, zeigen Entwicklungsverzögerungen und können zusätzlich schwerwiegende neurologische Symptome wie Ataxie, Spastizität, Epilepsie und einen sensorineuralen Hörverlust entwickeln. Die biologische Funktion der Ribonuklease T2 (RNase T2) ist bisher nicht ausreichend untersucht. Außerdem besteht in der Literatur Uneinigkeit über die subzelluläre Lokalisation und Sekretion der RNase T2. Vor diesem Hintergrund sollte diese Arbeit maßgeblich zur Aufklärung der subzellulären Lokalisation der RNase T2 beitragen und eine mögliche Sekretion im Mausmodell beweisen. Die Expressionsanalyen von RNase T2 in dieser Arbeit wurden an embryonalen immortalisierten Maus-Fibroblasten (iMEFs) und in murinen Geweben durchgeführt. Die Expression von Rnaset2 in iMEFs wurde dabei mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion untersucht. Dabei zeigte sich eine geringe endogene Expression in iMEFs, welche durch Western Blot-Analysen bestätigt wurde. Die Expression von RNase T2 in murinen Gewebeschnitten wurde indirekt anhand immunhistochemischer Färbungen von β-Galaktosidase untersucht. Ermöglicht wurde diese indirekte Expressionsanalyse durch Substitution von Rnaset2 mit einem Reportergen. Hierbei konnte eine Expression von RNase T2 in Hepatozyten, Kardiomyozyten, Tubulus-Epithelzellen, Megakaryozyten und in Zellen des blutbildenden Systems nachgewiesen werden. Ferner wurde in dieser Arbeit die subzelluläre Lokalisation der RNase T2 in iMEFs mittels eines markierten RNase T2-Konstrukts durch eine Immunfluoressenz- und hochauflösende Spinning Disk Konfokal-Mikroskopie untersucht. Dabei konnten für die RNase T2 intrazelluläre Lokalisationen im Endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat sowie in frühen Endosomen und Exosomen qualitativ gezeigt und quantitativ validiert werden. Lokalisationen der RNase T2 in Lysosomen und Mitochondrien konnten hingegen in iMEFs nicht nachgewiesen werden. Vor diesem Hintergrund ist eine Exosomen-vermittelte Sekretion der RNase T2 anzunehmen. Daher wurde in dieser Arbeit die Sekretion und Endozytose von RNase T2 anhand eines markierten RNase T2-Konstrukts in Western Blot-Analysen in iMEFs untersucht. Dabei konnte eine Sekretion von RNase T2 erstmals durch Nachweis der RNase T2 in Zell-Überständen nachgewiesen werden. Eine Endozytose von RNase T2 ließ sich experimentell durch Western Blot-Analysen unter den gewählten Bedingungen nicht in iMEFs beweisen. Die Erkenntnisse dieser Arbeit erweitern das grundlegende Verständnis über mögliche Funktionen der RNase T2. Sie tragen wesentlich zur Einordnung der funktionellen Zusammenhänge einer Immunregulation durch die RNase T2 bei und bilden damit die Grundlage für weiterführende experimentelle Untersuchungen sowie für die Entwicklung möglicher therapeutischer Strategien.
Schlagwörter: RNAse T2; RNASET2; Leukenzephalopathie; Interferonopathie; Ribonuklease T2; Sekretion; Lokalisation; Expression