Maize Root Colonization by Trichoderma virens: Mechanisms of Defense against Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) and Implications for Multi-Trophic Interactions

by Noor Agha Nawakht
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-08-04
Date of issue:2025-08-19
Advisor:Prof. Dr. Michael Rostás
Referee:Prof. Dr. Marko Rohlfs
Referee:Dr. Christian Baden
Referee:Dr. Artemio Mendoza-Mendoza
Sponsor:The work was made possible with the support of a scholarship from the German Academic Exchange Service (DAAD).
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11448

 

 

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Abstract

English

Summary Trichoderma spp. are widely recognized as root-colonizing biocontrol agents that enhance plant resistance to biotic and abiotic stresses while promoting growth. These fungi produce a diverse array of volatile and non-volatile metabolites that mediate interactions with plants, influencing both direct and indirect defense mechanisms. Trichoderma can enhance direct plant resistance against herbivores and modulate the emission of herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) that attract natural enemies. Previous studies have demonstrated that T. virens and its vir4 knockout mutant (deficient in sesquiterpene biosynthesis) differentially influence maize (Zea mays L.) root gene expression and specialized metabolites. Given these metabolic alterations, we hypothesized that fungal root colonization could have cascading effects on higher trophic levels. This dissertation investigates how T. virens and its vir4 mutant influence maize defense responses, focusing on volatile and non-volatile metabolites and phytohormonal signaling pathways, and their subsequent effects on tri-trophic interactions involving the herbivore Helicoverpa armigera and the predator Macrolophus pygmaeus. Additionally, we assess the bioactivity of T. virens-derived, sesquiterpenes-based metabolites on herbivore performance. Chapter 1 examines the impact of T. virens root colonization on H. armigera performance, as well as potential alterations in HIPV emissions and their ultimate influence on predator attraction in olfactometer assays. Our findings indicate that H. armigera larvae feeding on maize colonized by wild-type T. virens gained significantly less weight compared to those feeding on plants colonized by the vir4 mutant or uncolonized controls, suggesting that the vir4 gene cluster contributes to herbivore resistance. Although fungal colonization induced moderate changes in HIPV composition, total volatile emissions remained unaffected. Furthermore, in Y-tube olfactometer assays, M. pygmaeus displayed a strong preference for herbivore-damaged maize over undamaged plants, but fungal colonization had no significant impact on predator attraction. These results demonstrate that T. virens enhances maize's direct resistance against H. armigera while maintaining indirect defense mechanisms. Chapter 2 investigates the effects of fungal colonization on maize's non-volatile defense responses, including specialized and primary metabolites as well as phytohormonal signaling pathways. High-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS) analysis revealed that benzoxazinoids (BXDs), the predominant class of maize secondary metabolites involved in plant defense, as well as the phenolic compound chlorogenic acid, were primarily induced by herbivory, with minimal alterations due to fungal colonization. A similar trend was observed for phytohormones, with herbivory acting as the primary driver of hormonal changes. However, untargeted metabolomic profiling using LC-QTOF-MS/MS system identified distinct metabolic shifts in fungal-inoculated seedlings, particularly those colonized by the wild-type strain. Feeding damage by herbivore further augmented these metabolic changes. Similarly, primary metabolites were differentially affected by fungal colonization and herbivore feeding. These findings provide insights into our earlier observations of H. armigera larval significantly attenuated performance in the wild- type fungal-colonized seedlings which reinforces the role of T. virens vir4 gene in differentially regulating certain metabolic features in maize that led to the enhanced resistance against this herbivore. Chapter 3 is building on the findings from Chapter 2, which identified the T. virens vir4-derived sesquiterpene lactone heptelidic acid as a potential biomarker influencing fungal–plant–herbivore interactions and contributing to reduced herbivore performance. This chapter focuses on the extraction and purification of heptelidic acid and hydroheptelidic acid from wild-type T. virens and evaluates their larvicidal activity against H. armigera larvae. The results demonstrate that heptelidic acid significantly inhibited larval growth and exerted insecticidal effects at the tested concentrations. In contrast, hydroheptelidic acid exhibited limited larvicidal activity. These findings highlight the potential of T. virens-derived secondary metabolites as promising candidates for sustainable and eco-friendly pest management strategies targeting H. armigera. Overall, this dissertation deepens our understanding of how T. virens influences maize defensive chemistry and its broader impact within a multitrophic system. The findings highlight fungus-induced plant resistance mediated primarily by T. virens vir4 biosynthetic gene and underscore the key role of this plant-microbe symbiotic relationship in enhancing plant resistance, vitaly important in the context of sustainable crop protection. Our study further highlights the potential of T. virens as a source of vital bioactive secondary metabolites that could play a critical role in sustainable pest management of H. armigera.
Keywords: sesquiterpenes; Trichoderma virens; maize defense; volatile organic compounds (VOCs); Helicoverpa armigera; vir4 gene; untargeted metabolomics; GC–MS; LC–MS/MS, QQQ, QTOF; olfactometer; Macrolophus pygmaeus; phytohormones; benzoxazinoids; tri-trophic interactions; plant–microbe–insect interactions

German

Zusammenfassung Trichoderma-Arten sind als wurzelbesiedelnde Pilze bekannt, die die pflanzliche Resistenz gegenüber biotischen und abiotischen Stressfaktoren stärken und gleichzeitig das Pflanzenwachstum fördern. Diese Pilze produzieren eine Vielzahl von volatilen und nicht-nicht-volatilen Metaboliten, die in der Pflanze verschiedene Interaktionen vermitteln und sowohl direkte als auch indirekte Abwehrmechanismen beeinflussen. Trichoderma kann die direkte pflanzliche Abwehr gegenüber Herbivoren verstärken und die Emission von herbivor-induzierten Pflanzenvolatilen (HIPVs) modulieren, welche die natürlichen Feinde anlocken. Frühere Studien haben gezeigt, dass T. virens und dessen vir4-Knockout-Mutante (defizient in der Sesquiterpen-Biosynthese) die Genexpression und die Synthese spezialisierter Metaboliten in Maiswurzeln unterschiedlich beeinflussen. Aufgrund dieser metabolischen Veränderungen wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Besiedelung der Pflanzenwurzeln durch den Pilz kaskadierende Effekte auf höheren trophischen Ebenen auslösen könnte. Diese Dissertation untersucht, wie T. virens und seine vir4-Mutante die Abwehrreaktionen von Mais beeinflussen – mit besonderem Fokus auf volatilen und nicht-volatilen Metaboliten, phytohormonellen Signalwegen sowie deren Auswirkungen auf tritrophische Interaktionen mit dem Herbivor Helicoverpa armigera und dem Prädator Macrolophus pygmaeus. Zusätzlich wird die Bioaktivität sesquiterpenbasierter T. virens-Metaboliten auf die Entwicklung des Herbivors bewertet. Kapitel 1 befasst sich mit der Wirkung der Wurzelkolonisation durch T. virens auf die Fitness von H. armigera, potenzielle Veränderungen der HIPV-Emissionen sowie deren Einfluss auf die Anlockung von Prädatoren in Olfaktometer-Assays. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Larven von H. armigera, die sich von Mais ernährten, der mit dem Wildtyp von T. virens kolonisiert war, signifikant weniger Gewicht zulegten als Larven auf mit der vir4-Mutante kolonisierten oder nicht kolonisierten Pflanzen. Dies deutet darauf hin, dass das vir4-Gencluster zur Resistenz gegenüber Herbivoren beiträgt. Obwohl die Pilzbesiedelung moderate Veränderungen in der HIPV-Zusammensetzung hervorrief, blieben die Gesamtmenge der Volatilemissionen unbeeinflusst. Zudem zeigte M. pygmaeus in Y-Typ-Olfaktometer-Assays eine klare Präferenz für durch Herbivorie geschädigte Pflanzen gegenüber solchen, die nicht geschädigt waren, wobei die Pilzbesiedelung keinen signifikanten Einfluss auf die Prädatorenanziehung hatte. Diese Ergebnisse zeigen, dass T. virens die direkte Abwehrfähigkeit von Mais gegenüber H. armigera verbessert, während indirekte Verteidigungsmechanismen aufrechterhalten bleiben. Kapitel 2 untersucht die Auswirkungen der Pilzbesiedelung auf nicht-volatile Abwehrmechanismen, einschließlich spezialisierter und primärer Metaboliten sowie phytohormoneller Signalwege. HPLC-MS Analysen ergaben, dass Benzoxazinoide– die Hauptklasse sekundärer Maismetaboliten – sowie die phenolische Verbindung Chlorogensäure vorwiegend durch Herbivorie induziert wurden und nur geringfügig durch den Pilz beeinflusst waren. Ein ähnliches Muster zeigte sich bei den Phytohormonen, wobei auch hier die Herbivorie der Hauptauslöser hormoneller Veränderungen war. Dennoch ergab das Metabolomics-Profiling deutliche Verschiebungen im Metabolitenspektrum von Pilz-inokulierten Keimlingen, insbesondere bei solchen, die vom Wildtyp kolonisiert waren. Die Herbivorie verstärkte diese metabolischen Unterschiede zusätzlich. Auch Primärmetaboliten wurden durch Pilzbesiedelung und Herbivorie unterschiedlich beeinflusst. Diese Ergebnisse untermauern unsere früheren Beobachtungen, dass die Leistungsfähigkeit von H. armigera-Larven in Wildtyp-besiedelten Sämlingen signifikant reduziert war, was die Rolle des vir4-Gens von T. virens bei der Hochregulierung bestimmter metabolischer Merkmale in Mais hervorhebt. Diese führten letztlich zur verstärkten Resistenz gegen den Herbivoren. Kapitel 3 befasst sich mit der Extraktion und Reinigung von Heptelidsäure und Hydroheptelidsäure aus dem Wildtyp von T. virens und deren larvizider Wirkung auf H. armigera. Die Ergebnisse zeigen, dass Heptelidsäure das Larvenwachstum signifikant hemmte und in den getesteten Konzentrationen eine insektizide Wirkung entfaltete. Im Gegensatz dazu zeigte Hydroheptelidsäure nur geringe larvizide Aktivität. Diese Befunde unterstreichen das Potenzial T. virens-abgeleiteter Sekundärmetaboliten als vielversprechende Kandidaten für eine nachhaltige und umweltfreundliche Schädlingsbekämpfung. Insgesamt vertieft diese Dissertation unser Verständnis darüber, wie T. virens die chemische Abwehr von Mais beeinflusst und welche weitreichenden Effekte daraus in einem multitrophischen Kontext entstehen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die pilzinduzierte pflanzliche Resistenz maßgeblich durch das vir4-Biosynthesegen von T. virens vermittelt wird, und heben die zentrale Rolle dieser Pflanze-Pilz-Symbiose für die Verbesserung der Pflanzenresistenz im Rahmen eines nachhaltigen Pflanzenschutzes hervor. Zudem betont die Arbeit das Potenzial von T. virens als Quelle wertvoller bioaktiver Sekundärmetaboliten mit Bedeutung für eine zukunftsfähige Schädlingsbekämpfung.
 
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