Interfacial Protons vs. Bulk Protons: How Proton Localization Alters ATP Synthase Activity

by Hendrik Flegel
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-04-11
Date of issue:2025-09-22
Advisor:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Helmut Grubmüller
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11508

 

 

Files in this item

Name:Dissertation_Flegel.pdf
Size:47.3Mb
Format:PDF

This file will be freely accessible after 2026-04-10.

Abstract

English

This dissertation investigates proton transfer processes at biological membranes, focusing on the role of FOF1 ATP synthase as a proton consumer. ATP synthase plays a central role in cellular energy conversion by utilizing a proton gradient to synthesize ATP, yet the exact origin of these protons – whether from the bulk medium or transported along the membrane surface – remains unclear. The aim of this study was to determine whether ATP synthase preferentially utilizes protons from specific sources and to understand the mechanisms behind proton transfer to the protein. To address these questions, various model systems were developed using large unilamellar vesicles (LUVs) containing the TFOF1 ATP synthase from thermophilic Bacillus PS3. Proton sources included the water-soluble photoacid HPTS, mimicking bulk protons, and the amphiphilic derivative C12-HPTS, which releases protons attached to the membrane. By comparing these systems, the influence of proton localization on ATP synthase activity was evaluated. The vesicular models were characterized in terms of size, protein reconstitution efficiency, and protein orientation, with successful protein insertion confirmed. The photoacidity of both HPTS and C12-HPTS was assessed using absorbance and fluorescence spectroscopy, revealing that both compounds effectively release protons upon light excitation. A luminescence-based ATP synthesis assay was used to evaluate enzymatic activity, and time-correlated single photon counting (TCSPC) provided time-resolved insights into proton transfer dynamics. The results indicated that ATP synthase preferentially utilizes membrane-bound protons over bulk protons for ATP production, as evidenced by higher proton transfer rates and hints on an increased ATP production in systems containing C12-HPTS. These findings underscore the significance of membrane-bound proton sources for ATP synthesis and provide valuable insights into proton transfer mechanisms at biological membranes. This work contributes to the fundamental understanding of bioenergetic processes and has potential implications for biotechnological applications aimed at optimizing proton transport for energy production.
Keywords: ATP Synthase; Lipid Membrane; Proton Localization

German

Diese Dissertation untersucht Protonentransferprozesse an biologischen Membranen mit besonderem Fokus auf die Rolle der FOF1 ATP-Synthase als Protonenkonsument. Die ATP-Synthase spielt eine zentrale Rolle in der zellulären Energieumwandlung, indem sie einen Protonengradienten zur Synthese von ATP nutzt. Allerdings bleibt die genaue Herkunft dieser Protonen – ob aus dem wässrigen Medium oder durch lateralen Transport entlang der Membranoberfläche – unklar. Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, ob die ATP-Synthase bevorzugt Protonen aus bestimmten Quellen nutzt und wie diese Protonen das Protein erreichen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Modellsysteme auf Basis von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs) entwickelt, die die TFOF1 ATP-Synthase aus dem thermophilen Bacillus PS3 enthielten. Als Protonenquellen wurden die wasserlösliche Fotosäure HPTS, welche Protonen im wässrigen Medium freisetzt, sowie das amphiphile Derivat C12-HPTS, welches Membran-adhärierte Protonen freisetzt, verwendet. Durch den Vergleich dieser Systeme wurde der Einfluss der Protonenlokalisierung auf die Aktivität der ATP-Synthase untersucht. Die Vesikelmodelle wurden hinsichtlich ihrer Größe, der Effizienz der Proteinintegration und der Orientierung der Proteine charakterisiert. Die erfolgreiche Rekonstitution der ATP-Synthase wurde bestätigt. Die Fotoazidität von HPTS und C12-HPTS wurde mittels Absorptions- und Fluoreszenzspektroskopie analysiert und zeigte, dass beide Verbindungen nach Lichtanregung effektiv Protonen freisetzen. Die enzymatische Aktivität wurde mit einem lumineszenz-basierten ATP-Synthese-Assay untersucht, während zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) zeitaufgelöste Einblicke in die Protonentransferdynamik lieferte. Die Ergebnisse zeigten, dass ATP-Synthase bevorzugt membran-adhärierte Protonen zur ATPProduktion nutzt, was durch erhöhte Protonentransferraten und Hinweise auf eine gesteigerte ATP-Synthese in Systemen mit C12-HPTS gestützt wurde. Diese Erkenntnisse unterstreichen die Bedeutung membrangebundener Protonenquellen für die ATP-Synthese und liefern wertvolle Einblicke in Protonentransfermechanismen an biologischen Membranen. Diese Arbeit trägt zum grundlegenden Verständnis bioenergetischer Prozesse bei und könnte potenzielle Anwendungen in der Biotechnologie ermöglichen, insbesondere zur Optimierung des Protonentransports für die Energiegewinnung.