“Etablierung und Charakterisierung eines humanen Zellmodells zur Erforschung der Pathophysiologie der Alternierenden Hemiplegie des Kindesalters”
“Establishment and characterization of a human cell model to investigate the pathophysiology of alternating hemiplegia of childhood”
by Anika Marten
Date of Examination:2025-10-14
Date of issue:2025-10-06
Advisor:Prof. Dr. Hendrik Rosewich
Referee:Dr. Malte Tiburcy
Referee:Prof. Dr. Ralf Dressel
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11534
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Abstract
English
Alternating hemiplegia of childhood (AHC) is a rare, severe neurological disorder characterized by transient episodes of hemiplegia combined with other paroxysmal symptoms such as dystonia, nystagmus, seizures, and autonomic disturbances. The disease is caused by heterozygous mutations in the ATP1A3 gene which typically occur de novo as autosomal dominant mutations. ATP1A3 encodes the alpha-3 subunit of the P-type sodium-potassium ATPase, which is responsible for maintaining and restoring an electrochemical gradient in the plasma membrane and is exclusively expressed in neurons. To investigate the functional consequences of ATP1A3 mutations on the gene product in human neurons, the generation of neurons from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represents an elegant option due to the lack of direct access to patient tissue. The aim of this study was to establish and characterize a human in vitro cell system to investigate the pathogenesis of AHC. For this purpose, hiPSCs derived from human fibroblasts by reprogramming were characterized from two AHC patients with different underlying missense mutations (Val322Asp and Glu815Lys) and three neurologically healthy control patients, and their pluripotency was demonstrated using current methods. The re-differentiation of hiPSCs into neurons via neuronal progenitor cells was successfully achieved using two different protocols by dual Smad inhibition starting from the feeder-free system and by co-cultivation of hiPSCs with PA6 cells. Immunofluorescence staining was performed to verify the different cell stages as well as immunofluorescence co-staining against ATP1A3, each in combination with a membrane dye (membrane-binding fluorophore-cysteine-lysine-palmitoyl group, mCling) and a mitochondrial antibody (TOMM20) to identify the subcellular localization of ATP1A3. Our immunostaining results suggest that AHC is rather a functional problem than a localization problem of ATP1A3 and thus fit in with the results of other studies. By means of morphological characterization of the neurons themselves as well as the localization of ATP1A3 in relation to the cell membrane and mitochondria, the requirement for functional diagnostics using e.g. electrophysiological methods was provided. This work contributes to basic scientific research into the rare and clinically complex alternating hemiplegia of childhood.
Keywords: ATP1A3; AHC; Alternating hemiplegia of childhood; hiPSCs
German
Die Alternierende Hemiplegie des Kindesalters (AHC) ist eine seltene, schwerwiegende neurologische Erkrankung, die sich durch transiente Episoden von Hemiplegie in Kombination mit anderen paroxysmalen Symptomen wie Dystonie, Nystagmus, epileptischen Anfällen und autonomen Störungen auszeichnet. Hervorgerufen wird die Erkrankung durch heterozygote Mutationen im ATP1A3-Gen, die typischerweise de novo als autosomal dominante Mutationen vorliegen. Das ATP1A3-Gen kodiert die alpha-3-Untereinheit der P-Typ Natrium-Kalium-ATPase, die für den Erhalt und die Wiederherstellung eines elektrochemischen Gradienten der Plasmamembran verantwortlich ist und Neuronen-spezifisch exprimiert wird. Zur Erforschung der funktionellen Konsequenzen der Mutationen auf das Genprodukt in humanen Neuronen, stellt die Generierung von Neuronen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit beim direkten Zugriff auf Patientengewebe eine elegante Möglichkeit dar. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Charakterisierung eines humanen in vitro Zellsystem zur Erforschung der Pathogenese der AHC. Zu diesem Zweck wurden die aus humanen Fibroblasten durch Re-Programmierung gewonnen hiPSCs von zwei AHC-Patienten mit unter schiedlichen zugrundeliegenden Missense-Mutationen (Val322Asp und Glu815Lys) und drei neurologisch gesunden Kontrollpatienten charakterisiert und die Pluripotenz nach heute gängigen Methoden bewiesen. Die Re-Differenzierung der hiPSCs in Neurone über neuronale Vorläuferzellen gelang erfolgreich unter Anwendung zweier unterschiedlicher Protokolle durch duale Smad Inhibierung ausgehend vom feederfreien System sowie durch Co-Kultivierung der hiPSCs mit PA6-Zellen. Es erfolgten Immunfluoreszenzfärbungen zur Überprüfung der verschiedenen Zellstadien sowie Immunfluoreszenz-Cofärbungen gegen ATP1A3, jeweils in Kombination mit einem Membranfarbstoff (membrane-binding flourophore-cysteine-lysine-palmitoyl group, mCling) sowie einem mitochondrialen Antikörper (TOMM20) für die Identifikation der subzellulären Lokalisation von ATP1A3. Unsere mittels Immunfärbungen generierten Ergebnisse suggerieren, dass es sich bei der AHC eher um ein funktionelles Problem, als um ein Lokalisationsproblem von ATP1A3 handelt und reiht sich somit in die Ergebnisse anderer Studien ein. Mittels morphologischer Charakterisierung der Neurone an sich sowie der Lokalisation von ATP1A3 in Bezug auf Zellmembran und Mitochondrien wurde die Voraussetzung für die funktionelle Diagnostik mittels elektrophysiologischer Methoden gegeben. Die Arbeit trägt somit zur grundlagenwissenschaftlichen Erforschung der seltenen und klinisch komplexen alternierenden Hemiplegie des Kindesalters bei.
Schlagwörter: ATP1A3; Alternierende Hemiplegie des Kindesalters; AHC; hiPSCs
