Multimodal structural analysis of tissue specimens using x-ray phase contrast micro-CT based 3D virtual histology
Optimizing phase contrast based virtual histology
by Md Motiur Rahman Sagar
Date of Examination:2025-09-29
Date of issue:2025-10-24
Advisor:Prof. Dr. Christian Dullin
Referee:Prof. Dr. Christian Dullin
Referee:Prof. Dr. Christine Stadelmann-Nessler
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11584
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Format:PDF
Description:Cumulative Thesis including all articles
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Abstract
English
Histological analysis ofhumanand animal tissues is fundamental tomedical diagnosis and biomedical research, providing insights into disease mechanisms, progression, and treatment response. Traditional histology, involving the examination of stained, micrometer-thin tissue sections under an optical microscope, has been standard practice since the 1660s, but presents limitations, including tissue deformation from sectioning and restricted three-dimensional (3D) structural information due to its inherently two-dimensional (2D) nature. To address these drawbacks, 3D imaging modalities such as micro-CT, in particular, enables high-resolution imaging of larger specimens, however typically requires contrast-enhancing staining agents. In contrary, free propagation based imaging (PBI) technique such asX-ray phase contrast micro-CT (PCμCT), available at synchrotron facilities, offers label-free, non-destructive 3D imaging of soft tissues by exploiting differences in X-ray refractive indices rather than attenuation, providing superior contrast and facilitating advanced virtual histology. Despite the advantages of PCμCT, optimization of sample preparation remains essential, as conventional histological protocols are not fully compatible with PCμCT imaging requirements. This thesis contributes to the optimization of sample preparation techniques for the PBI method. We proposed an optical clearing protocol which enhances the compatibility of the tissue sample with the property of a single distance phase retrieval algorithm which results in an improved reconstruction of PCμCT scans. Additionally, phase-sensitive PBI, shows promise for high-resolution, low-dose lung imaging. To support clinical validation of this approach, we established a formaldehyde vapor fixation method which essentially preserves the inflated porcine lungs in their physiological state, enabling subsequent histopathological analysis. To further enhance PCμCT imaging, particularly in formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) lung tissue, we developed a conditional generative adversarial networks (cGANs)-based approach to suppress air artifacts that commonly hinder visualization and 3D structural analysis. Traditional methods and optimizations of phase retrieval algorithm have shown limitations, especially in resolving overlapping tissue interfaces and preserving structural fidelity. Our tailored cGANs architecture effectively replaces air-filled regions with realistic tissue structures, trained on a custom-generated paired dataset. This data preparation pipeline not only supports artifact correction in PCμCT but also holds potential for broader applications in medical image processing, including denoising and other types of artifact removal, where annotated training data are typically scarce. A key achievement of this work is the development of a multimodal, multiscale tissue analysis pipeline centered on FFPE lung specimens for PCμCT. This pipeline maintains spatial correlation across modalities and integrates structural data from PCμCT with histological sections and atomic force microscopy(AFM)measurements, enabling comprehensive analysis of heterogeneous pathological features such as fibrosis. Our integrated approach addresses the limitations of non-specific contrast in virtual histology and supports clinical validation of PBI findings through alignment with established pathological and imaging standards. The pipeline was applied in a rat model of ventilator-induced lung injury (VILI) to investigate the structural and mechanical implications of lung fibrosis. By combining semi-automatic image analysis, AFM-based stiffness measurements, and histological evaluation, the study revealed that fibrotic remodeling may enhance mechanical resilience to VILI. These results, suggest a potential protective role of fibrosis under mechanical ventilation stress and providing novel insights into the biomechanical basis of lung injury. This research collectively introduces a powerful, integrative imaging workflow that represents a significant advancement in the field of pulmonary pathology. The methodologies developed hold significant promise for future translational research and clinical diagnostics by enabling high-resolution, artifact-reduced visualization of lung tissue in both physiological and pathological states.
Keywords: x-ray; phase-contrast; synchrotron; FFPE; cGAN; optical-clearing; BABB; virtual histology; artifact-suppression; 3D; VILI; Artificial Intelligence
German
Die histologische Analyse von menschlichen und tierischen Geweben ist für die medizinische Diagnostik und biomedizinische Forschung von grundlegender Bedeutung, da sie Einblicke in Krankheitsmechanismen, den Krankheitsverlauf und das Ansprechen auf Behandlungen liefert. Die traditionelle Histologie, bei der gefärbte, mikrometerdünne Gewebeschnitte unter einem Lichtmikroskop untersucht werden, ist seit den 1660er Jahren etabliert. Diese Analysemethode weist jedoch Einschränkungen auf. Zum einen treten Gewebeverformungen durch das Schneiden auf und zum anderen sind aufgrund ihrer inhärenten 2D-Natur 3D-Strukturinformationen limitiert. Um diese Nachteile zu umgehen, werden insbesondere 3D Bildgebungsverfahren angewandt, wie zum Beispiel die Mikro-Computertomographie (μCT), die sich zur hochauflösenden Bildgebung größerer Proben eignet, jedoch in der Regel die Verwendung kontrastverstärkender Färbemittel erfordert. Als weitere zerstörungsfreie 3D-Bildgebungsmodalität steht die Röntgen-Phasenkontrast-Bildgebung in freier Ausbreitung (PBI), wie die Röntgenphasen- Mikro-CT (PCμCT), in Synchrotron-Einrichtungen zur Verfügung. Diese erlaubt die Analyse von ungefärbten Weichgeweben, indem sie zusätzlich zur Abschwächung der Röntgenstrahlen, auch die Unterschiede in ihren Brechungsindizes nutzt. Dadurch wird ein hervorragender Kontrast erzielt undeine innovative virtuelle Histologie ermöglicht. Um die Vorteile der PCμCT nutzen zu können, ist eine besondere Probenvorbereitung erforderlich, da herkömmliche histologische Protokolle nicht vollständig mit den Anforderungen derPCμCT- Bildgebung kompatibel sind. Die hier vorgestellte Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zur Optimierung der Probenvorbereitungstechniken für diePCμCT-Methode. Dafür haben wir ein optisches Aufklarungsprotokoll angewendet, das die Kompatibilität von Gewebeproben mit den Voraussetzungen des Single- Distance-Phase-Retrieval-Algorithmus erhöht und zu einer verbesserten Rekonstruktion ihrer PCμCT- Scans führt. Da die phasensensitive PBI vielversprechend insbesondere für die hochauflösende Bildgebung der Lunge bei niedrigsten Röntgendosen ist, haben wir eine Formaldehyd-Dampf-Fixierungsmethode etabliert, um die klinische Validierung dieses Ansatzes zu ermöglichen. Hierbei werden Schweinelungen in ihrem physiologischen expandierten Zustand konserviert und anschließend histopathologisch untersucht. Um die PCμCT-Bildgebung insbesondere von diesem formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Lungengewebe weiter zu verbessern, haben wir einen auf "conditional generative artificial networks" (cGANs) basierenden Ansatz entwickelt. Dieser unterdrückt Artefakte, die durch eingeschlossene Luft in den FFPE-Proben entstehen und häufig die Visualisierung und 3D-Strukturanalyse behindern. Darüber hinaus erwiesen sich herkömmlicheMethoden und Optimierungen zur Berechnung der Phasenverschiebung in den aufgenommenen Daten ("phase retrieval") als begrenzt, insbesondere in ihrer Fähigkeit gleichzeitig unterschiedliche Gewebegrenzflächen auszuwerten. Im Gegensatz dazu ersetzt unsere maßgeschneiderte cGANs-Architektur luftgefüllte Bereiche effektiv durch realistische Gewebestrukturen, die anhand speziell generierter Datensatz-Paare trainiert wurden. Dadurch unterstützt die hier präsentierte Datenaufbereitungs Pipeline nicht nur die Korrektur von Artefakten in PCμCT Daten, sondern hat darüber hinaus Potenzial für die breitere Anwendungen in der medizinischen Bildverarbeitung, einschließlich Rauschunterdrückung und anderer Arten der Artefaktentfernung, bei der annotierte Trainingsdaten in der Regel rar sind. Ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit ist die Entwicklung einer multimodalen, multiskaligen Gewebeanalyse- Pipeline, die auf PCμCT Bilddaten von FFPE-Lungenproben basiert. Diese Pipeline bewahrt die räumliche Korrelation zwischen verschiedenen Modalitäten und integriert Strukturdaten der PCμCT mit histologischen Schnitten und Messungen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) Sie, ermöglicht damit eine umfassende Analyse heterogener pathologischer Merkmale, wie zum Beispiel Lungenfibrose. Dieser integrierte Ansatz überwindet die Einschränkungen des unspezifischen Kontrasts der virtuellen Histologie und unterstützt die Validierung von PBI-Befunden durch die Angleichung an bereits etablierte pathologische und bildgebende Standards. Die Pipeline wurde in einem Rattenmodell für beatmungsinduzierte Lungenschäden ("ventilator induced lung injury" - VILI) angewandt, um die strukturellen und mechanischen Auswirkungen von Lungenfibrose zu untersuchen. Durch die Kombination von halbautomatischer Bildanalyse, AFM-basierter Steifigkeitsmessung und histologischer Auswertung konnte die Studie zeigen, dass fibrotische Umbaureaktionen die mechanische Widerstandsfähigkeit gegenüber VILI verbessern können, was auf eine potenziell schützende Rolle der Lungenfibrose unter mechanischer Beatmungsbelastung hindeutet und neue Einblicke in die biomechanischen Grundlagen von Lungenschäden liefert. Diese Forschungsarbeit stellt insgesamt einen leistungsstarken, integrativen Rahmen vor, der ein hohes Potential besitzt die Bildanalyse der Lunge zu verbessern. Des Weiteren versprechen die entwickeltenMethoden eine zukünftige Translation in die Forschung und klinische Diagnostik, da sie eine hochauflösende, artefaktreduzierte Visualisierung von Lungengewebe, sowohl im physiologischen als auch im pathologischen Zustand, ermöglichen.
Schlagwörter: x-ray; phase-contrast; synchrotron; FFPE; cGAN; optical-clearing; BABB; virtual histology; artifact-suppression; 3D; VILI; Artificial Intelligence
