Morphological and functional consequences of an AAV-mediated Foxo3 knockdown on C2C12 myoblasts

by Benjamin Gellhaus
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-11-17
Date of issue:2025-11-03
Advisor:Prof. Dr. Dominik Saul
Referee:Prof. Dr. Dominik Saul
Referee:Prof. Dr. Laura C. Zelarayán
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11608

 

 

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Abstract

English

Sarcopenia is a common disease in the elderly and hospitalized population, leading to a higher risk of falling and hospitalization, resulting in increased healthcare costs and significantly reduced quality of life. Current therapies, mainly based on physical activity and nutritional support, are limited in hospitalized patients, highlighting the need for novel approaches. With that background, the transcription factor Foxo3 plays a pivotal role, as it is inactivated in anabolic situations, whereas in catabolic situations, Foxo3 expresses the muscle-specific ubiquitin ligase Fbox32, driving protein degradation. The hypothesis is that an AAV-mediated long-term Foxo3 knockdown in C2C12 myoblasts results in lower levels of Fbxo32, which in turn leads to an enhanced morphology and function. An in silico analysis revealed elevated Foxo3 expression in aged mice and the most differentially expressed genes were associated with human muscle atrophy diseases. To establish a myogenic differentiation model in vitro, C2C12 wild-type cells were transduced with AAV2 vectors carrying a plasmid for either control or Foxo3-targeting siRNAs. Transduced cells were selected by FACS to generate mono- and polyclonal lines, with siControl K8 and siFoxo3 K2 chosen for further experiments based on comparable growth characteristics. They were further differentiated into myotubes for 9 days. In the subsequent experiment, a successful, stable and long-term FOXO3 knockdown at protein level was confirmed from day 3 onwards. The morphological analysis demonstrated a delayed differentiation, leading to the formation of smaller and less fused myotubes due to the Foxo3 knockdown. These results were reflected in the functional evaluation. Here, the Foxo3 knockdown myotubes exhibited a longer time to peak and longer contraction duration. Mechanistically, as a consequence of the FOXO3 knockdown at the protein level, there is a compensatory upregulation of Foxo1, which also expresses the Fbox32. FOXO3 plays a role in the regulation of Myod1 expression, which is crucial during early differentiation. Foxo3 plays a crucial role in maintaining cellular integrity. Consequently, the FOXO3 knockdown at the protein level results in DNA double-strand breaks, as indicated by an upregulation of Atm and further Tp53 expression. Tp53 is a driver of Foxo3 expression and inhibits the Myog expression, which is crucial for myoblast fusion in later differentiation. In conclusion, the initial hypothesis was falsified. The AAV2-mediated long-term FOXO3 knockdown prior to differentiation inhibited its own initiation of differentiation and further inhibited its later differentiation with myoblast fusion depending on Atm and Tp53 expression
Keywords: Sarcopenia, Skeletal Muscle, Foxo3, Myod1, Myog

German

Sarkopenie ist eine häufige Erkrankung bei älteren und hospitalisierten Patienten. Sie führt zu einem erhöhten Risiko für Stürze und Hospitalisierung, was wiederum zu höheren Gesundheitskosten und einer deutlichen Einschränkung der Lebensqualität führt. Die derzeitigen Therapieansätze, die hauptsächlich auf körperlicher Aktivität und ernährungsphysiologischer Unterstützung basieren, sind bei hospitalisierten Patienten eingeschränkt, was die Notwendigkeit neuer Behandlungsansätze unterstreicht. Vor diesem Hintergrund spielt der Transkriptionsfaktor Foxo3 eine zentrale Rolle, da er unter anabolen Bedingungen inaktiviert wird, während er unter katabolen Bedingungen die Expression der muskelspezifischen Ubiquitin-Ligase Fbxo32 induziert, die den Proteinabbau antreibt. Die Hypothese war, dass ein AAV-vermittelter, langfristiger Foxo3-Knockdown in C2C12 Myoblasten zu niedrigeren Fbxo32-Spiegeln führt, was wiederum zu einer verbesserten Morphologie und Funktion führt. Eine in silico Analyse zeigte eine erhöhte Foxo3-Expression bei gealterten Mäusen, und die am unterschiedlichsten exprimierten Gene standen in Zusammenhang mit menschlichen Muskelatrophieerkrankungen. Um ein myogenes Differenzierungsmodell in vitro zu etablieren, wurden C2C12 Wildtypzellen mit AAV2-Vektoren transduziert, die entweder ein Kontrollplasmid oder Foxo3-spezifische siRNAs enthielten. Die transduzierten Zellen wurden mittels FACS selektiert, um mono- und polyklonale Zelllinien zu erzeugen, wobei siControl K8 und siFoxo3 K2 aufgrund vergleichbarer Wachstumseigenschaften für die weiteren Experimente ausgewählt wurden. Anschließend wurden diese über 9 Tage zu Myotuben differenziert. In den folgenden Experimenten konnte ab Tag 3 ein stabiler und langfristiger FOXO3-Knockdown auf Proteinebene nachgewiesen werden. Die morphologische Analyse zeigte eine verzögerte Differenzierung, die zur Bildung kleinerer und weniger fusionierter Myotuben führte. Diese Ergebnisse spiegelten sich auch in der funktionellen Analyse wider. Myotuben mit Foxo3-Knockdown zeigten eine verlängerte Zeit bis zum Kontraktionsmaximum, sowie eine verlängerte Kontraktionsdauer. Mechanistisch führte der FOXO3-Knockdown auf Proteinebene zu einer kompensatorischen Hochregulation von Foxo1, das ebenfalls die Expression von Fbxo32 förderte. FOXO3 spielt zudem eine Rolle bei der Regulation der Myod1-Expression, die in frühen Differenzierungsphasen entscheidend ist, sowie bei der Aufrechterhaltung der zellulären Integrität. Der Knockdown von FOXO3 führte zu DNA-Doppelstrangbrüchen, was die Hochregulation von Atm und nachfolgend Tp53 offenbarte. Tp53 ist ein Induktor der Foxo3-Expression und hemmt die Expression von Myog, welches in späteren Differenzierungsphasen für die Myoblastenfusion entscheident ist. Zusammenfassend konnte die initiale Hypothese widerlegt werden. Der AAV2-vermittelte langfristige FOXO3-Knockdown vor Beginn der Differenzierung hemmte sowohl die Initiation der Differenzierung, als auch die spätere Myoblastenfusionin Abhängigkeit von Atm- und Tp53-Expression.
 
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