Die Wirkung von Baicalein und Zileuton auf das Knochengewebe am ovarektomierten Rattenmodell

by Maximilian Konrad Franz
Doctoral thesis
Date of Examination:2025-11-24
Date of issue:2025-11-20
Advisor:PD Dr. Marina Komrakova
Referee:PD Dr. Ihtzaz Ahmed Malik
Referee:Prof. Dr. Holger Reichardt
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11644

 

 

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Abstract

English

Osteoporosis is the most common metabolic bone disease worldwide and has gained increasing attention in research, not only due to a progressively aging population but also because of its broad impact on patients, society, and healthcare systems. The most prevalent form, postmenopausal osteoporosis, represents one of the most frequent bone disorders in industrialized countries. Triggered by the postmenopausal decline in estrogen, the condition is characterized by reduced bone density, leading to impaired bone strength and an elevated risk of fractures. Lipoxygenases constitute a family of enzymes that participate in inflammatory processes and are implicated in disorders such as asthma and psoriasis. Moreover, they are involved in the pathogenesis of osteoporosis through interleukin- and tumor necrosis factor-α-mediated mechanisms. Baicalein, a flavonoid that inhibits lipoxygenases 12 and 15, has long been used in Traditional Chinese Medicine and has more recently been shown to exert beneficial effects in chronic inflammatory diseases. Zileuton, a benzothiophene N-hydroxyurea derivative, inhibits 5-lipoxygenase, an enzyme essential for leukotriene synthesis. Its ability to reduce leukotriene production forms the basis for its therapeutic use in asthma. Previous in vitro and in vivo studies have suggested positive effects of both agents on bone tissue. This study aimed to assess whether prophylactic treatment and combined administration of baicalein and zileuton could provide additional benefits for bone. An established ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis was used, as it exhibits bone loss characteristics comparable to those seen in humans. The femur and lumbar vertebrae were selected for evaluation because they are among the most commonly affected sites of osteoporotic fractures. Seventy female Sprague Dawley rats were randomized into five groups. At twelve weeks of age, 56 animals were ovariectomized to induce a postmenopausal osteoporotic state. Among these, one group received baicalein, another received zileuton, and a third received a combination of both agents, each administered via diet at a dosage of 10 mg/kg body weight. One ovariectomized group remained untreated, while a non-ovariectomized group served as healthy controls. Thirteen weeks after ovariectomy, serum, femora, and lumbar vertebrae were collected for analysis. Bone structure was assessed using 2D and 3D micro-CT. Biomechanical properties, such as stability and elasticity, were assessed through compression testing of the lumbar vertebrae and a three-point bending test of the femora. After ashing, the bones were analyzed to determine their organic and inorganic composition, along with phosphate, calcium, and magnesium content. Serum levels of alkaline phosphatase, osteocalcin, RatLaps, calcium, magnesium, and phosphorus were also evaluated. Statistical differences were assessed using one-way analysis of variance (ANOVA; p < 0.05) and Tukey–Kramer post hoc testing (p < 0.05). The results of our study demonstrate that ovariectomy in rats leads to alterations in various parameters. Specifically, increases in body weight, food intake, and serum alkaline phosphatase were observed, while uterine weight and most bone parameters decreased. These changes are consistent with the expected effects of ovariectomy on bone properties in rats. The previously reported beneficial effects of baicalein and zileuton could not be confirmed under the conditions of extended treatment and prophylactic administration. Baicalein treatment led only to minor alterations, with a reduction in bone and trabecular volume. Zileuton showed similarly weak effects, reflected in an increased calcium-to-phosphate ratio in bone. Combined administration of baicalein and zileuton resulted in reductions in bone and cortical volume, cortical density, and the calcium-to-phosphate ratio. Most bone and serum parameters did not differ from the untreated OVX group. Notably, results from 2D micro-CT differed from those of 3D analysis; since 3D analysis considered the entire bone, these findings were prioritized in interpretation. The lipoxygenase inhibitors had no observable effect on body weight, food intake, or uterine weight. Similarly, they did not influence the biomechanical properties of the bones. In conclusion, prophylactic oral administration of the lipoxygenase inhibitors baicalein and zileuton, whether given individually or in combination, exerted only minor effects on femoral and vertebral bone tissue in ovariectomized rats. Moreover, combination therapy was associated with predominantly negative effects, indicating that these agents cannot be recommended for prophylactic treatment of osteoporosis. Future research should focus on the potential role of lipoxygenase inhibitors in chronic inflammation and associated markers in postmenopausal osteoporosis to better define the therapeutic window for their use.
Keywords: Baicalein; Zileuton; osteoporosis; lipoxygenase inhibitors; postmenopausal

German

Die Osteoporose, als weltweit häufigste metabolische Knochenerkrankung, rückt nicht nur auf Grund einer zunehmend alternden Bevölkerung in den Fokus der Forschung. Diese Erkrankung hat auch weitreichende Folgen für Betroffene sowie für die Gesellschaft und das Gesundheitssystem. Die häufigste Form ist die postmenopausale Osteoporose, welche eine der häufigsten Knochenerkrankungen der Industrieländer ist. Hervorgerufen durch den postmenopausalen Östrogenabfall, ist diese Erkrankung durch eine verminderte Knochendichte charakterisiert und führt zu einer verminderten Festigkeit der Knochen mit erhöhtem Frakturrisiko. Lipoxygenasen sind eine Familie von Enzymen, die über ihre Produkte an Entzündungsvorgängen im Körper beteiligt sind, so zum Beispiel bei entzündlichen Erkrankungen wie Asthma oder Psoriasis. Zudem sind Lipoxygenasen über Interleukine und den Tumor-Nekrose-Faktor-⍺ an der Pathogenese der Osteoporose beteiligt. Das Flavonoid Baicalein ist ein Inhibitor der Lipoxygenasen 12 und 15. Nachdem dieses Präparat schon lange in der traditionellen chinesischen Medizin eingesetzt wurde, bestätigen neuere Studien eine positive Wirkung in der Behandlung von Krankheiten mit chronischer Entzündung. Zileuton ist ein Benzothiophen N-Hydroxyharnstoff und inhibiert die Lipoxygenase 5, welche an der Synthese von Leukotrienen beteiligt ist. Auf Grund der Reduktion der Leukotriene durch die Inhibierung der Lipoxygenase 5 wird Zileuton in der Therapie von Asthma eingesetzt. In mehreren Studien zu diesen beiden Präparaten zur Behandlung der Osteoporose, sowohl in vitro als auch in vivo, zeigten sich positive Eigenschaften der beiden Lipoxygenaseinhibitoren Baicalein und Zileuton auf das Knochengewebe. Ziel dieser Studie war es zu erforschen, ob eine prophylaktische Behandlung sowie eine kombinierte Anwendung von Baicalein und Zileuton weitere Vorteile für den Knochen bringen. Für diese Untersuchung wurde das ovarektomierte Rattenmodel gewählt, das bereits in der Forschung zur postmenopausalen Osteoporose etabliert ist. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Charakteristika des Knochenschwundes ähnlich zu denen beim Menschen sind. Das Femur und der Lendenwirbelkörper wurden für die Versuche gewählt, da diese beiden Knochen sehr häufig von osteoporotischen Frakturen betroffen sind. Für den Versuch wurden 70 weibliche Sprague Dawley Ratten randomisiert in fünf Gruppen eingeteilt. Im Alter von 12 Wochen wurden 56 Tiere ovarektomiert, um den Zustand einer postmenopausalen Osteoporose hervorzurufen. Von den ovarektomierten Tieren wurde eine Gruppe mit Baicalein, eine mit Zileuton und eine mit einer Kombination aus beiden in einer Dosierung von 10 mg/kg KG über das Futter behandelt. Eine ovarektomierte Gruppe wurde nicht therapiert und diente als ovarektomierte Kontrollgruppe. Eine weitere Kontrollgruppe bestand aus den nicht-ovarektomierten gesunden Tieren. 13 Wochen nach der Ovarektomie wurden Serum, Femora und Lendenwirbelkörper für weitere Untersuchungen entnommen. Zur Untersuchung der Knochenstruktur wurden in einer Mikro-Computertomographie 2D- und 3D-Bilder erstellt und analysiert. In einem Kompressionstest an den Lendenwirbelkörpern und einem Drei-Punkte-Bruchtest an den Femora wurden die biomechanischen Eigenschaften wie die Stabilität und die Elastizität der Knochen gemessen. Nach Veraschung der Knochen wurden die organischen und anorganischen Knochenanteile sowie der Phosphat-, Kalzium- und Magnesiumanteil bestimmt. Des Weiteren erfolgte die Bestimmung von alkalischer Phosphatase, Osteocalcin, RatLaps, Kalzium, Magnesium und Phosphor im Serum. Die statistischen Unterschiede wurden mittels one way analysis of variance (p < 0,05) sowie durch den Tukey-Kramer-post-hoc-Test (p < 0,05) bestimmt. Die Ergebnisse unserer Studie belegen, dass eine Ovarektomie bei Ratten zu Veränderungen verschiedener Knochenparameter führt. Dabei wurde eine Zunahme des Körpergewichts, der Futteraufnahme und der alkalischen Phosphatase im Serum beobachtet, während das Uterusgewicht und die meisten Knochenparameter abnahmen. Diese Veränderungen entsprechen den zu erwartenden Auswirkungen einer Ovarektomie auf die Knocheneigenschaften von Ratten. Die zuvor berichteten positiven Effekte von Baicalein und Zileuton konnten durch einen längeren Behandlungszeitraum und durch eine prophylaktische Applikation in dieser Studie nicht bestätigt werden. Die Behandlung mit Baicalein führte lediglich zu einer geringfügigen Veränderung der Knochenparameter, wobei eine Reduktion des Knochen- und Trabekelvolumens zu beobachten war. Der Effekt von Zileuton war ebenfalls von geringer Intensität, was sich in einer Erhöhung des Kalzium-Phosphat-Verhältnisses im Knochen manifestierte. Die Kombination der beiden Substanzen Baicalein und Zileuton resultierte in einer Reduktion des Knochen- und Kortikalisvolumens, der Kortikalisdichte sowie des Kalzium-Phosphat-Verhältnisses. Die Mehrzahl der Knochen- und Serumparameter wies im Vergleich zur unbehandelten OVX-Gruppe keine Veränderung auf. Die mittels 2D-Mikro-CT-Analyse gewonnenen Daten wichen von den mittels 3D-Analyse ermittelten Daten ab. Aufgrund der Betrachtung des gesamten Knochens im Rahmen in der 3D-Analyse wurde bei der Dateninterpretation der Fokus auf diese Ergebnisse gelegt. Ein Einfluss der Lipoxygenaseinhibitoren auf das Körpergewicht, die Futteraufnahme und die Uterusgewichte der Tiere wurde nicht beobachtet. Ebenso zeigte sich keine Wirkung auf die biomechanischen Knocheneigenschaften. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine prophylaktische orale Applikation der Lipoxygenaseinhibitoren Baicalein und Zileuton und einer Kombination aus beiden nur geringe Auswirkungen auf das Knochengewebe des Femurs und des Lendenwirbelkörpers der ovarektomierten Ratte hat. Zudem zeigten sich vor allem durch die Kombination negative Effekte auf das Knochengewebe, sodass diese Lipoxygenaseinhibitoren nicht als prophylaktische Therapie der Osteoporose empfohlen werden können. In zukünftigen Studien könnte die Anwendung von Lipoxygenaseinhibitoren in Bezug auf die chronische Entzündung bzw. die Entzündungsmarker im Rahmen einer postmenopausalen Osteoporose untersucht werden und dadurch der optimale Zeitpunkt für deren Einsatz bestimmt werden.
Schlagwörter: Baicalein; Zileuton; Osteoporose; Lipoxygenaseinhibitoren; postmenopausal