Enhancing RNAi-Based Pest Control through Effective Target Gene Selection and Optimal dsRNA Design

by Doga Cedden
Cumulative thesis
Date of Examination:2025-11-26
Date of issue:2025-12-04
Advisor:Prof. Dr. Gregor Bucher
Referee:Prof. Dr. Gregor Bucher
Referee:Prof. Dr. Michael Rostás
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11679

 

 

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Abstract

English

The growing global population demands new strategies for sustainable pest management. Chemical insecticides, while historically successful in controlling pest populations to protect agricultural yields and suppress disease vectors, face critical restrictions and issues, as their use has led to environmental harm and development of insecticide-resistance. RNA interference (RNAi) has emerged as a potential alternative, offering species-specific and environmentally friendly pest control through the delivery of double-stranded RNA (dsRNA) to silence essential pest genes. Despite commercial progress and advances in dsRNA delivery technologies, several challenges limit the large-scale application of RNAi-based pest control strategies. These challenges include lower efficacy compared to chemical insecticides, a delay between dsRNA uptake and the onset of lethal effects, and a lack of response to dsRNA in many important pest species. Selecting the most effective target gene and optimizing the dsRNA sequence have the potential to improve efficacy, thereby helping to overcome some of the main challenges in RNAi-based pest control. Chapter 1 provides a general introduction to the thesis topics, focusing on the mechanism of RNAi and its application in pest control, while linking the state of the literature to the aims of the thesis. The main aims of this thesis are to establish standardized approaches for effective target gene identification in insect pests and to optimize dsRNA sequences for improved insecticidal efficacy. A further overarching goal is to develop data-driven and user-friendly computational tools that allow researchers to translate these insights into RNAi-based pest control applications. These aims have both scientific and practical implications, as they have the potential to accelerate research on identifying the best target genes and designing optimal dsRNA sequences, thereby improving insecticidal efficacy in field applications and reducing the cost of RNAi-based pest control. Chapter 2 investigates the transferability of effective target genes identified in a genome-wide RNAi screen in the red flour beetle, Tribolium castaneum, to a major oilseed rape pest, the cabbage stem flea beetle, Psylliodes chrysocephala. The results revealed moderate transferability (~50%) of highly effective targets from T. castaneum, which increased to approximately 80% when considering genes already validated in other leaf beetles. These findings are conceptually important, as they demonstrate partial but significant cross-species transferability of RNAi targets, and practically valuable, as they can guide the development of RNAi-based solutions against this important pest. Chapter 3 is a review article that synthesizes progress in identifying effective RNAi target genes across insect pests. Drawing on genome-wide data from T. castaneum, experimental results from Chapter 2, and other transfer studies, it highlights that effective RNAi targets are largely distinct from the targets of conventional chemical insecticides. The chapter argues that unbiased, screen-based approaches outperform hypothesis-driven gene selection due to the unpredictable influence of cellular processes on RNAi efficacy. Finally, it compiles a curated list of highly effective RNAi targets validated across multiple pest species, providing an important resource for future discovery efforts. Chapter 4 hypothesizes that the efficacy of RNAi-based pest control depends on the sequence features of the small interfering RNAs (siRNAs) processed from delivered dsRNAs. To test this, siRNAs with different sequence parameters were evaluated in T. castaneum by targeting an essential gene and measuring insecticidal efficacy. These data, together with insights from the siRNA therapeutics literature, were used to develop an algorithm that enriches efficacy-associated siRNA features during dsRNA design. In most cases, this algorithm improved the insecticidal performance of dsRNA treatments in T. castaneum and two other coleopteran pests. The dsRNA sequence optimization algorithm, as well as tools for identifying effective target genes in pests and minimizing risks to non-target species, were integrated to develop the dsRIP web platform (https://dsrip.uni-goettingen.de), which offers a comprehensive pipeline for enhancing RNAi-based pest control. Chapter 5 demonstrates the application of the dsRIP pipeline to the hop flea beetle, Psylliodes attenuata, a key pest of hop plants. Three dsRNAs with lethal and feeding-inhibitory effects were efficiently identified, demonstrating the feasibility of RNAi for managing this pest for the first time and highlighting the utility of dsRIP as a comprehensive pipeline for establishing new pest species. Chapters 6 and 7 adopt an exploratory approach and use high-throughput sequencing following insecticidal dsRNA delivery to gain novel insights into the mode of action of RNAi-based pest control at the molecular level. Chapter 6 combines RNA degradomics, small RNA-seq, and proteomics to characterize the mode of action of a proteasome-targeting insecticidal dsRNA at the molecular level. Interestingly, the study identified discrepancies between siRNA abundance and target mRNA cleavage patterns. This suggests that increasing the abundance of siRNAs with the highest cleavage efficacies might be an additional strategy to enhance dsRNA efficacy. Chapter 7 investigates the processing of insecticidal dsRNA into siRNAs using small RNA-seq from T. castaneum injected with many different dsRNAs. The key advantage of this chapter compared to the existing literature is the extensive number of different dsRNAs included in the small RNA-seq experiments, which provided an opportunity to understand general dsRNA processing patterns. Notable observations included lower siRNA production from the sense, but not the antisense, strand at dsRNA termini, and no influence of changes in dsRNA processing frames on the siRNA pools. Finally, Chapter 8 concludes with a general discussion of the thesis findings, highlighting their potential to facilitate and improve research and applications in RNAi-based pest control, while also addressing notable remaining gaps and future directions.
Keywords: dsRNA; RNAi; siRNA; optimization; pest control

German

Das weltweite Bevölkerungswachstum erfordert neue Strategien für ein nachhaltiges Schädlingsmanagement. Chemische Insektizide waren zwar historisch erfolgreich bei der Kontrolle von Schädlingspopulationen, um landwirtschaftliche Erträge zu sichern und Krankheitsüberträger zu unterdrücken, stoßen jedoch auf erhebliche Einschränkungen. Ihr Einsatz hat zu Umweltschäden und zur Entwicklung von Insektizidresistenzen geführt. RNA-Interferenz (RNAi) hat sich als mögliche Alternative herausgestellt. Sie bietet eine artspezifische und umweltfreundliche Schädlingsbekämpfung durch die Verabreichung von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die lebenswichtige Gene in Schädlingen ausschaltet. Trotz kommerzieller Fortschritte und neuer Technologien zur dsRNA-Abgabe gibt es mehrere Hürden für eine breite Anwendung von RNAi-basierten Methoden. Zu diesen Herausforderungen gehören eine geringere Wirksamkeit im Vergleich zu chemischen Insektiziden, eine Verzögerung zwischen der Aufnahme von dsRNA und dem Eintritt tödlicher Effekte sowie das Ausbleiben einer Reaktion auf dsRNA bei vielen wichtigen Schädlingsarten. Die Auswahl der wirksamsten Zielgene und die Optimierung der dsRNA-Sequenzen können die Effektivität verbessern und damit helfen, einige der größten Herausforderungen der RNAi-basierten Schädlingsbekämpfung zu überwinden. Kapitel 1 gibt eine allgemeine Einführung in die Themen der Arbeit, erklärt den Mechanismus von RNAi und ihre Anwendung in der Schädlingsbekämpfung und verknüpft den Stand der Forschung mit den Zielen der Dissertation. Die Hauptziele dieser Arbeit sind die Entwicklung standardisierter Ansätze zur Identifizierung wirksamer Zielgene in Insektenschädlingen und die Optimierung von dsRNA-Sequenzen zur Steigerung der insektiziden Wirksamkeit. Ein übergeordnetes Ziel ist die Entwicklung datenbasierter und benutzerfreundlicher computergestützter Werkzeuge, die es Forschern ermöglichen, diese Erkenntnisse praktisch für RNAi-Anwendungen umzusetzen. Diese Ziele haben sowohl wissenschaftliche als auch praktische Bedeutung, da sie die Suche nach den besten Zielgenen beschleunigen und die Gestaltung optimaler dsRNA-Sequenzen erleichtern können. Damit soll die Wirksamkeit von RNAi in Feldanwendungen verbessert und die Kosten reduziert werden. Kapitel 2 untersucht, ob sich wirksame Zielgene, die in einem genomweiten RNAi-Screening im Roten Mehlkäfer Tribolium castaneum identifiziert wurden, auf einen wichtigen Rapsschädling, den Großer Rapserdfloh Psylliodes chrysocephala, übertragen lassen. Die Ergebnisse zeigten eine moderate Übertragbarkeit (~50 %) hochwirksamer Zielgene aus T. castaneum, die auf etwa 80 % anstieg, wenn Gene berücksichtigt wurden, die bereits bei anderen Blattkäfern validiert waren. Diese Ergebnisse sind konzeptionell bedeutsam, da sie eine teilweise, aber deutliche Übertragbarkeit von RNAi-Zielen zwischen Arten zeigen. Gleichzeitig sind sie praktisch wertvoll, da sie die Entwicklung von RNAi-Lösungen gegen diesen Schädling unterstützen können. Kapitel 3 ist ein Übersichtsartikel, der die Fortschritte bei der Identifizierung wirksamer RNAi-Zielgene über verschiedene Insektenschädlinge hinweg zusammenfasst. Es nutzt die genomweiten Daten von T. castaneum, die Ergebnisse aus Kapitel 2 und weitere Transferstudien. Dabei wird hervorgehoben, dass wirksame RNAi-Ziele sich stark von den klassischen Zielen chemischer Insektizide unterscheiden. Das Kapitel argumentiert, dass unvoreingenommene, screeningbasierte Ansätze besser sind als hypothesengetriebene Gen-Auswahl, da zelluläre Prozesse die RNAi-Wirksamkeit unvorhersehbar beeinflussen. Schließlich wird eine kuratierte Liste hochwirksamer RNAi-Ziele zusammengestellt, die bereits in mehreren Schädlingen validiert wurden – eine wichtige Ressource für künftige Entdeckungen. Kapitel 4 stellt die Hypothese auf, dass die Wirksamkeit von RNAi von den Sequenzmerkmalen der kleinen interfering RNAs (siRNAs) abhängt, die aus den verabreichten dsRNAs gebildet werden. Um dies zu testen, wurden siRNAs mit unterschiedlichen Sequenzparametern in T. castaneum untersucht, indem ein essentielles Gen gezielt wurde und die insektizide Wirkung gemessen wurde. Diese Daten, zusammen mit Erkenntnissen aus der siRNA-Therapieforschung, dienten zur Entwicklung eines Algorithmus, der Wirksamkeitsmerkmale bei der dsRNA-Entwicklung berücksichtigt. In den meisten Fällen verbesserte dieser Algorithmus die insektizide Leistung von dsRNA-Behandlungen in T. castaneum und zwei weiteren Käferarten. Der Optimierungsalgorithmus sowie Werkzeuge zur Identifizierung von Zielgenen und zur Risikominimierung für Nicht-Zielarten wurden in die Webplattform dsRIP integriert (https://dsrip.uni-goettingen.de). Diese Plattform bietet eine umfassende Pipeline zur Verbesserung der RNAi-basierten Schädlingsbekämpfung. Kapitel 5 zeigt die Anwendung dieser Pipeline am Hanferdfloh, Psylliodes attenuata, einem wichtigen Schädling von Hopfenpflanzen. Drei dsRNAs mit tödlicher und fraßhemmender Wirkung wurden erfolgreich identifiziert. Damit wurde erstmals die Machbarkeit von RNAi zur Bekämpfung dieses Schädlings gezeigt und der Nutzen von dsRIP verdeutlicht. Kapitel 6 und 7 verfolgen einen explorativen Ansatz und nutzen Hochdurchsatz-Sequenzierung nach der Gabe von insektizider dsRNA, um neue Einblicke in den Wirkmechanismus der RNAi zu gewinnen. Kapitel 6 kombiniert RNA-Degradomik, small RNA-seq und Proteomik, um die Wirkungsweise einer proteasomzielenden dsRNA auf molekularer Ebene zu charakterisieren. Überraschenderweise zeigten sich Unterschiede zwischen siRNA-Mengen und den Spaltungsmustern der Ziel-mRNAs. Dies deutet darauf hin, dass eine Erhöhung der Menge an siRNAs mit der höchsten Spaltungswirksamkeit ein weiterer Ansatz zur Verbesserung von dsRNA sein könnte. Kapitel 7 untersucht die Verarbeitung insektizider dsRNA in siRNAs anhand von small RNA-seq in T. castaneum, das mit vielen verschiedenen dsRNAs behandelt wurde. Der Vorteil dieses Kapitels liegt in der großen Anzahl untersuchter dsRNAs, die ein tieferes Verständnis allgemeiner Verarbeitungsmuster ermöglicht. Auffällig war eine geringere siRNA-Produktion vom Sense-Strang, jedoch nicht vom Antisense-Strang, an den Enden der dsRNAs sowie keine Wirkung von Änderungen im Leserahmen der dsRNA auf die entstehenden siRNA-Pools. Kapitel 8 schließt mit einer allgemeinen Diskussion der Ergebnisse. Es wird betont, dass die Arbeit Forschung und Anwendung der RNAi-basierten Schädlingsbekämpfung erleichtern und verbessern kann. Gleichzeitig werden bestehende Lücken und mögliche zukünftige Forschungsrichtungen aufgezeigt.
 
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