Analyse der simultanen RANKL-Inhibition und OPG-Expressionssteigerung durch Virus-Partikel vermittelte RNA-Interferenz im Ratten-Tiermodell

Analysis of simultaneous RANKL-inhibition and OPG-upregulation through virus-like particle mediated RNA-interference in a rat model

by Jule Albrecht
Doctoral thesis
Date of Examination:2026-01-14
Date of issue:2025-12-18
Advisor:PD Dr. Daniel Hoffmann
Referee:PD Dr. Daniel Hoffmann
Referee:Prof. Dr. Heide Siggelkow
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11718

 

 

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Abstract

English

Osteoporosis is characterized by an imbalance in bone metabolism with a predominance of bone resorption, with the RANK–RANKL–OPG signaling pathway controlling osteoclast differentiation. The aim of this work was to establish simultaneous RANKL-inhibition and OPG-upregulation in the bone of healthy female rats by means of virus-like particles (VLPs) carrying siRNA against RANKL and/or OPG-DNA cassettes, as well as to investigate a possible retard-effect through application of the VLPs in chitosan-gel. Forty-eight rats were divided into control groups (no injection, VLPs with control-siRNA, VLPs with a GFP-construct) and several intervention groups that received either two intraperitoneal injections of VLPs with OPG-DNA cassettes and/or siRANKL within 7 days, or a single injection of chitosan-gel containing VLPs loaded with OPG-DNA cassettes and/or siRANKL. After 3, 7, or 14 days, the rats were sacrificed and the tibiae were collected. RANKL and OPG expression was determined by qRT-PCR (∆∆CT-method, β2-microglobulin as reference gene) and by Western blot. For protein detection, an extensively optimized Western blot protocol was developed, including comparison of different lysis buffers, transfer methods, antibodies, and normalization strategies; OPG was quantified using a stain-free based approach, and RANKL was quantified after a parallel gel run with normalization to total protein content. qPCR revealed significant reductions in RANKL-mRNA of approximately 30–70% compared with controls in all intervention groups, with the strongest knockdown after a single injection of chitosan containing VLPs and siRANKL. OPG-mRNA was significantly increased in a time-limited manner by OPG-DNA cassettes and in several groups with combined interventions, whereas siRANKL alone did not increase OPG-mRNA. A pronounced decrease in RANKL-mRNA was also observed after administration of OPG-DNA alone. Chitosan led to more prolonged low expression levels of RANKL-mRNA, while no consistent retard-effect was seen for OPG-mRNA. Western blots confirmed marked increases in OPG-protein levels to more than twice the control values, whereas reductions in RANKL-protein were only significant depending on time point and group and showed overall higher variability. The results demonstrate that both a VLP-mediated RANKL-knockdown by siRNA and an OPG-upregulation by OPG-DNA cassettes can be achieved in rat bone and that OPG-DNA apparently also influences RANKL-mRNA. A clear additive effect of the simultaneous intervention on the RANKL-knockdown could not be demonstrated, whereas the data for OPG indicate an additional effect of the combination. Despite intensive methodological optimization, interpretation of the protein data is limited by the small number of animals, lack of replicates, and antibody-specific issues. In contrast, the qPCR data exhibited high methodological quality and allow intriguing insights into the complex regulatory mechanisms in the RANKL–OPG system that extend beyond simple receptor–ligand interaction.
Keywords: osteoporosis; Virus‑like particles (VLPs); RANKL knockdown; RANKL; OPG; OPG upregulation; RNA interference; siRNA; osteoprotegerin; RANK/RANKL/OPG signaling pathway

German

Die Osteoporose ist durch ein Ungleichgewicht im Knochenstoffwechsel mit Überwiegen des Knochenabbaus gekennzeichnet, wobei der RANK RANKL OPG Signalweg die Osteoklastendifferenzierung steuert. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer simultanen RANKL-Inhibition und OPG-Expressionssteigerung durch virusähnliche Partikel (VLP) mit siRNA gegen RANKL und/oder OPG-DNA-Kassetten im Knochen gesunder weiblicher Ratten sowie die Untersuchung eines möglichen Retard-Effekts durch Applikation der VLP in Chitosan-Gel. 48 Ratten wurden in Kontrollgruppen (keine Injektion, VLP mit Kontroll-siRNA, VLP mit GFP-Konstrukt) und mehrere Interventionsgruppen eingeteilt, die entweder zweimal intraperitoneal VLP mit OPG-DNA Kassetten und/oder siRANKL oder einmal die mit OPG-DNA-Kassetten und/oder siRANKL beladenen VLP in Chitosan-Gel erhielten. Nach 3, 7 oder 14 Tagen wurden die Ratten getötet und die Tibiae entnommen. Die Expression von RANKL und OPG wurde mittels qRT-PCR (∆∆CT Methode, β2 Mikroglobulin als Referenzgen) sowie mittels Western Blot bestimmt. Für den Proteinnachweis wurde ein umfangreich optimiertes Western-Blot-Protokoll mit Vergleich verschiedener Lysepuffer, Transfermethoden, Antikörper und Normalisierungsstrategien entwickelt; OPG wurde stain-free basiert, RANKL nach parallelem Gel-Ansatz und Normalisierung auf die Gesamtproteinmenge quantifiziert. Die qPCR zeigte in allen Interventionsgruppen signifikante Reduktionen der RANKL-mRNA um etwa 30–70% gegenüber den Kontrollen, mit dem stärksten Knockdown nach einmaliger Injektion von Chitosan mit VLP und siRANKL. OPG-mRNA ließ sich durch OPG-DNA-Kassetten und in mehreren Gruppen mit kombinierter Intervention zeitlich begrenzt signifikant steigern, während alleinige siRANKL-Gabe die OPG-mRNA nicht erhöhte. Auffällig war ein ausgeprägter RANKL-mRNA-Abfall auch nach alleiniger OPG-DNA-Gabe. Chitosan führte für RANKL-mRNA zu länger anhaltend niedrigen Expressionsniveaus, während sich für OPG-mRNA kein konsistenter Retard Effekt zeigte. Western Blots bestätigten deutliche OPG-Protein-Expressionssteigerungen bis über das Doppelte der Kontrollwerte, während der RANKL-Protein-Knockdown nur Zeitpunkt- und gruppenabhängig signifikant waren und insgesamt eine höhere Variabilität aufwiesen. Die Ergebnisse belegen, dass sowohl ein VLP-vermittelter RANKL-Knockdown durch siRNA als auch eine OPG-Expressionssteigerung durch OPG-DNA-Kassetten im Rattenknochen erreichbar sind und dass OPG-DNA offenbar zusätzlich die RANKL-mRNA beeinflusst. Ein klarer additiver Effekt der simultanen Intervention auf den RANKL-Knockdown ließ sich nicht nachweisen, für OPG sprechen die Daten hingegen für einen zusätzlichen Einfluss der Kombination. Trotz intensiver methodischer Optimierung sind die Proteinbefunde durch begrenzte Tierzahl, fehlende Replikate und Antikörper-spezifische Probleme eingeschränkt interpretierbar. Im Gegensatz dazu wiesen die qPCR-Daten eine hohe methodische Qualität auf und erlauben spannende Rückschlüsse auf die komplexen Mechanismen. Insgesamt deuten die Daten auf komplexe Regulationsmechanismen im RANKL–OPG-System hin, die über eine einfache Rezeptor–Ligand-Interaktion hinausgehen.
Schlagwörter: Osteoporose; RNA-Interferenz; RANKL; OPG; RANKL-Inhibition; OPG-Expressionssteigerung; virus-like particles; Chitosan; siRNA; Osteoprotegerin; RANK/RANKL/OPG Signalweg; RANKL-Knockdown