Der arrhythmogene Effekt des Knockdowns von kardialem Troponin C auf atriale Kardiomyozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen
The arrhythmogenic effect of cardiac troponin C expression knockdown in atrial induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes
by Dominik Hubricht
Date of Examination:2026-02-17
Date of issue:2025-12-18
Advisor:Prof. Dr. Niels Voigt
Referee:Prof. Dr. Niels Voigt
Referee:PD Dr. Michael Didié
Referee:Prof. Dr. Dr. Tobias Brügmann
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11721
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Format:PDF
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Abstract
English
Atrial fibrillation is the most frequent cardiac arrhythmia; nevertheless, its pathophysiology is still insufficiently understood. Available therapeutic approaches have high recurrence rates, and complications of both atrial fibrillation itself - such as thromboembolic events - and of the accompanying therapy - such as an increased bleeding risk - must not be neglected. In atrial cardiomyocytes from patients with persistent atrial fibrillation, reduced expression of cardiac troponin C as well as decreased Ca2+ buffering have been demonstrated. Cytosolic Ca2+ buffering is largely mediated by troponin C. Since physiologically about 99% of cytosolic Ca2+ is bound to buffers, even small changes in Ca2+ buffers are likely to have considerable effects on cardiomyocyte function. The focus of this work was to investigate the effects of the loss of cardiac troponin C on cardiomyocyte Ca2+ homeostasis and to evaluate the arrhythmogenic potential of these changes. Atrial cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells were modeled with reduced troponin C expression using small interfering ribonucleic acids. The success of the knockdown was verified by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction as well as by Western blots. As a control, identical cells transfected with non-specific small interfering ribonucleic acids were used. The modeled cells were examined electrophysiologically with patch-clamp and by epifluorescence microscopy using Ca2+ indicators simultaneosly. In addition, epifluorescence-based measurements of action potentials and of diastolic Ca2+ leak from the sarcoplasmic reticulum were performed, as well as measurements of Ca2+ sparks using confocal laser microscopy. Further Western blots assessed the expression of junctophilin 2 as well as the expression and phosphorylation status of ryanodine receptor 2 and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. Both the mRNA amount and the protein amount of cardiac troponin C were successfully reduced in the cells. In cells with reduced troponin C expression, an increased amplitude of the systolic Ca2+ transient and of the caffeine-induced Ca2+ transient was observed despite an unchanged Ca2+ content of the sarcoplasmic reticulum. Analysis of the total Ca2+ amount derived from the Na+/Ca2+ exchanger current in relation to the amount of free Ca2+ corresponding to the caffeine-induced Ca2+ transient showed reduced Ca2+ buffering in cells with reduced troponin C expression. In the modeled cells, the occurrence of action potential alternans at lower stimulation frequencies as well as an increased frequency of diastolic Ca2+ sparks could be observed. Both are known mechanisms of atrial arrhythmias. Investigations of diastolic Ca2+ leak from the sarcoplasmic reticulum and the Western blots for ryanodine receptor 2, Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II, and junctophilin 2 indicate that the reduced Ca2+ buffering is responsible for these arrhythmogenic events in the modeled cardiomyocytes. Treatment of the cells with the Ca2+ sensitizer EMD57033 was able to normalize the frequency of Ca2+ spark occurrence, suggesting that modulation of the remaining Ca2+ buffers could be a possible therapeutic target in the treatment of persistent atrial fibrillation. Loss of troponin C in atrial fibrillation appears to be part of long-term remodeling processes and could thus contribute to an arrhythmogenic substrate that supports the maintenance of atrial fibrillation. This work was the first to show that reduced troponin C expression causes reduced Ca2+ buffering, which, among other effects, leads to an increased Ca2+ spark frequency. These arrhythmogenic changes could play a role in the development and maintenance of atrial fibrillation and enable new therapeutic approaches.
Keywords: iPSC-CM; atrial fibrillation; calcium signaling; electrophysiology; cardiac arrhythmias; troponin C; protein knockdown
German
Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung, trotzdem ist die Pathophysiologie noch unzureichend verstanden. Verfügbare Therapieverfahren haben eine hohe Rezidivquote und die Komplikationen sowohl des Vorhofflimmerns, wie z. B. thromboembolische Ereignisse oder negative Auswirkungen auf die Herzleistung, als auch der begleitenden Therapie, wie z. B. ein erhöhtes Blutungsrisiko, sind nicht zu vernachlässigen. In atrialen Kardiomyozyten von Patient*innen mit persistierendem Vorhofflimmern konnte eine reduzierte Expression des kardialen Troponin C sowie eine erniedrigte Ca2+-Pufferung nachgewiesen werden. Die zytosolische Ca2+-Pufferung wird wesentlich von Troponin C vermittelt. Da physiologisch etwa 99 % des zytosolischen Ca2+ an Puffer gebunden vorliegt, ist davon auszugehen, dass bereits kleine Veränderungen der Ca2+-Puffer erhebliche Auswirkungen auf die Funktion der Kardiomyozyten haben. Der Fokus dieser Arbeit lag darauf, die Auswirkungen des Verlusts von kardialem Troponin C auf den Ca2+-Haushalt der Kardiomyozyten zu untersuchen und das arrhythmogene Potenzial dieser Veränderungen zu evaluieren. Dazu wurden mit Hilfe von small interfering Ribonukleinsäuren von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitete atriale Kardiomyozyten mit reduzierter Troponin-C-Expression modelliert. Der Erfolg des so vermittelten Knockdowns wurde mit der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion mit reverser Transkription sowie mit Western-Blots überprüft. Als Kontrolle dienten gleichartige Zellen, die mit nicht-spezifischen small interfering Ribonukleinsäuren transfiziert wurden. Die modellierten Zellen wurden an einem Patch-Clamp-Messplatz simultan elektrophysiologisch und mit Hilfe von Ca2+-Indikatoren epifluoreszenzmikroskopisch untersucht. Außerdem wurden epifluoreszenzbasierte Messungen der Aktionspotenziale und der diastolischen Ca2+-Leckage des sarkoplasmatischen Retikulums der Zellen sowie Messungen von Ca2+-Sparks mit Hilfe konfokaler Lasermikroskopie durchgeführt. In weiteren Western-Blots wurden die Expression von Junctophilin 2 sowie die Expression und der Phosphorylierungsstatus des Ryanodinrezeptors 2 und der Ca2+-Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II untersucht. Sowohl die Menge der mRNA als auch die Proteinmenge des kardialen Troponin C konnten in den Zellen erfolgreich reduziert werden. In den Zellen mit reduzierter Troponin-C-Expression zeigte sich eine erhöhte Amplitude des systolischen Ca2+-Transienten sowie des koffeininduzierten Ca2+-Transienten trotz unverändertem Ca2+-Gehalt des sarkoplasmatischen Retikulums. Die Auswertung der aus dem Na+-Ca2+-Austauscher-Strom abgeleiteten Ca2+-Gesamtmenge in Relation zur Menge des freien Ca2+, die dem koffeininduzierten Ca2+-Transienten entspricht, zeigte eine reduzierte Ca2+-Pufferung in den Zellen mit reduzierter Troponin-C-Expression. In den modellierten Zellen konnten ein Auftreten von Alternanz-Phänomenen des Aktionspotenzials bei niedrigeren Stimulationsfrequenzen sowie eine erhöhte Frequenz diastolischer Ca2+-Sparks beobachtet werden. Beides sind bekannte Mechanismen atrialer Arrhythmien. Die Untersuchungen zur diastolischen Ca2+-Leckage des sarkoplasmatischen Retikulums und die Western-Blots von Ryanodinrezeptor 2, Ca2+-Calmodulin-abhängiger Proteinkinase II und Junctophilin 2 zeigen, dass in den modellierten Kardiomyozyten die reduzierte Ca2+-Pufferung für diese arrhythmogenen Ereignisse verantwortlich ist. Die Behandlung der Zellen mit dem Ca2+-Sensitizer EMD57033 konnte die Frequenz des Auftretens der Ca2+-Sparks normalisieren, sodass eine Modulation der verbliebenen Ca2+-Puffer ein mögliches therapeutisches Ziel bei der Behandlung von persistierendem Vorhofflimmern sein könnte. Der Verlust von Troponin C bei Vorhofflimmern scheint Teil langfristiger Remodeling-Prozesse zu sein und könnte so zu einem arrhythmogenen Substrat beitragen, das die Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern unterstützt. Diese Arbeit konnte erstmals zeigen, dass eine reduzierte Troponin-C-Expression eine reduzierte Ca2+-Pufferung bedingt, die u. a. zu einer erhöhten Ca2+-Sparks-Frequenz führt. Diese arrhythmogenen Veränderungen könnten eine Rolle im Rahmen der Entstehung und Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern spielen und neue therapeutische Ansätze ermöglichen.
Schlagwörter: Vorhofflimmern; Calcium-Stoffwechsel; Elektrophysiologie; kardiale Arrhythmien; Troponin C; Protein Knockdown; iPSC-CM
