Diagnostische Leistungsfähigkeit nichtinvasiver Pränataltests zur Bestimmung fetaler Merkmale des Rh-Blutgruppensystems

Diagnostic Performance of Non-Invasive Prenatal Testing for the Determination of Fetal Rh Blood Group Genotyping

by Bjarne Maaßen
Doctoral thesis
Date of Examination:2026-01-26
Date of issue:2026-01-06
Advisor:Prof. Dr. Tobias Legler
Referee:Prof. Dr. Tobias Legler
Referee:PD Dr. Gerd-Johannes Bauerschmitz
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11739

 

 

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Abstract

English

Over the past approximately 25 years, analysis of cell-free fetal DNA (cffDNA) from maternal plasma has enabled the non-invasive assessment of genetically determined fetal characteristics. Non-invasive prenatal testing (NIPT) complements invasive procedures such as amniocentesis and chorionic villus sampling, which are associated with a low but relevant risk of miscarriage, particularly in the prenatal detection of aneuploidies and fetal Rh blood group antigens. This approach is of particular clinical relevance in pregnancies complicated by maternal alloimmunization against Rh antigens, as antigen-positive fetuses are at risk of developing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN). The introduction of antenatal and postnatal anti-D immunoprophylaxis has led to a substantial reduction in anti-D alloimmunization rates. However, in the absence of prenatal knowledge of the fetal RhD status, all RhD-negative pregnant women historically received unselective anti-D prophylaxis, despite approximately 40% carrying an RhD-negative fetus. Prenatal determination of the fetal RhD status by NIPT enables a targeted anti-D prophylaxis strategy, limited to RhD-negative women carrying an RhD-positive fetus. Following an amendment of the German maternity guidelines, prenatal RhD determination was included in the statutory health insurance benefit catalogue in 2021. At that time, no commercially available test kit was capable of meeting the increased demand for prenatal RhD analyses. In a retrospective cohort, 707 pregnancies were evaluated by comparing NIPT results with postnatal serological typing of neonatal Rh antigens (RhD, C, c, and E). Prenatal results were confirmed in 185 cases; one false-positive RhD result and one false-negative result for the Rhc antigen were identified. The latter was detected upon repeat testing later in pregnancy, enabling close surveillance with middle cerebral artery Doppler ultrasound and anti-c antibody titer monitoring. In the prospective part of the study, fetal RhD status was determined by detection of RHD exons 5, 7, and 10 using the commercial FetoGnost-Kit-RhD following DNA extraction with the QIAsymphony SP system. Complete concordance with an established reference assay was observed in all 186 cases. In an extended cohort of 1,403 women aged 16–47 years (median: 31 years) sampled between gestational weeks 9 and 38 (median: 20 weeks), postnatal RhD phenotypes of the neonates were obtained by follow-up questionnaires. Of 1,696 total cases, NIPT-RhD yielded 1,589 conclusive results, comprising 998 RhD-positive and 591 RhD-negative findings. Based on 523 postnatal confirmations, sensitivity was 99.68% (95% CI: 98.21–99.94%, n = 313) and specificity was 99.05% (95% CI: 96.59–99.74%, n = 210). One false-negative result was potentially attributable to an extended sample transport time of seven days, while two false-positive results originated from the same analytical run, suggesting an increased likelihood of cross-contamination. Overall, the FetoGnost-Kit-RhD in combination with the QIAsymphony SP demonstrated high analytical precision and suitability for high-throughput prenatal RhD determination from gestational week 11+0 onward. No significant differences in diagnostic accuracy were observed across pregnancy trimesters. Samples obtained before gestational week 8 showed methodological limitations. Prolonged transport times were associated with significantly increased hemolysis rates, with 93.3% of hemolytic samples exhibiting transport durations exceeding five days, potentially contributing to false-negative results. A maximum transport time of five days is therefore recommended. Maternal or fetal RHD variants were identified in 1.2% of cases. Maternal RHD variants were reliably detected and allowed definitive fetal RhD classification in approximately two-thirds of cases based on exons absent in maternal DNA. Spike-in experiments suggested multiplex PCR as a robust approach in this context. Fetal RHD variants were also reliably identified; however, the applied methodology did not allow definitive prediction of RhD phenotype or immunogenicity. Consequently, anti-D prophylaxis is recommended when fetal RHD variants are detected. Attempts to sequence fetal RHD variants from maternal plasma using next-generation sequencing were unsuccessful. Plasma samples from pregnant women could be stored at 4 °C for up to seven days without adverse effects. For internal quality control and external proficiency testing, storage was feasible for at least 14 months at −20 °C and over 25 months at −80 °C.
Keywords: Non-invasive prenatal testing (NIPT); Cell-free fetal DNA (cffDNA); Cell-free DNA (cfDNA); Prenatal genetic testing; Prenatal screening; Molecular prenatal diagnostics; Rh blood group system; RhD; Fetal RhD genotyping; Prenatal RhD determination; RHD gene; RHD exon analysis; RHD variants; Rh antigens; RhC, Rhc, RhE; Anti-D immunoprophylaxis; Targeted anti-D prophylaxis; Maternal alloimmunization; Red cell alloantibodies; Hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN); Fetomaternal hemorrhage; Transfusion medicine; Immunohematology; Diagnostic accuracy; Sensitivity and specificity; Clinical performance; Analytical performance; False-negative results; False-positive results; Quality assurance; Multiplex PCR; Real-time PCR; DNA extraction; Plasma samples; Preanalytical variables; Sample transport; Hemolysis; High-throughput testing; Pregnancy; Gestational age; First trimester; Second trimester; Third trimester; Prenatal care; Targeted screening; Clinical implementation; Screening strategy; Public health policy; Maternity guidelines

German

Seit etwa 25 Jahren besteht die Möglichkeit, zellfreie fetale DNA aus mütterlichem Blut nichtinvasiv auf genetisch determinierte Merkmale zu untersuchen. Damit werden invasive Verfahren wie Amniozentese und Chorionzottenbiopsie, die mit einem niedrigen Abortrisiko verbunden sind, in bestimmten Bereichen ergänzt, etwa bei der pränatalen Erkennung von Aneuploidien und fetalen genetischen Rh-Blutgruppenmerkmalen. Dies ist besonders relevant bei der Risikoevaluierung von Schwangerschaften, in denen die Mutter gegen ein Antigen des Rh-Blutgruppensystems immunisiert ist, da bei einem Fetus mit dem entsprechenden Antigen das Risiko für einen Morbus haemolyticus neonatorum besteht. Die Einführung der pränatalen und postnatalen Anti-D-Prophylaxe führte zu einem deutlichen Rückgang der Anti-D-Sensibilisierungsrate. In Unkenntnis des pränatalen fetalen RhD-Status erhielt jedoch jede RhD-negative Schwangere eine ungezielte Anti-D-Prophylaxe, obgleich der Fetus in 40% der Fälle das RhD-Antigen nicht exprimierte. Die pränatale Bestimmung des fetalen RhD-Status (NIPT-RhD) ermöglicht den Übergang zu einer gezielten Anti-D-Prophylaxe, welche nur RhD-negative Mütter mit einem RhD-positiven Fetus erhalten. Durch eine Änderung der Mutterschaftsrichtlinien wurde die pränatale Bestimmung des RhD-Status im Jahr 2021 in den Leistungskatalog der gesetzlichen Krankenkassen aufgenommen. Vor dieser Arbeit existierte kein kommerziell erhältliches Testkit, das der erhöhten Nachfrage an pränatalen RhD-Analysen gerecht werden konnte. In einem retrospektiven Teil wurden 707 Patientinnen hinsichtlich des postnatalen blutgruppenserologischen Status der Rh-Antigene RhD, C, c und E der Neugeborenen befragt und das Ergebnis mit dem des nichtinvasiven Pränataltests verglichen. In 185 Fällen wurde das pränatale Ergebnis bestätigt, während ein falsch positiver RhD-Status sowie ein falsch negatives Ergebnis für das Rh-Antigen c festgestellt wurden. Letzteres konnte bei einer Wiederholungsuntersuchung zu einem späteren Zeitpunkt während derselben Schwangerschaft nachgewiesen werden, sodass auch diese Schwangerschaft engmaschig mit Doppler-Sonographie der Arteria cerebri media und Kontrollen des Anti-c-Titers überwacht wurde. In einem prospektiven Teil wurde der fetale RhD-Status durch die Detektion der RHD Exons 5, 7 und 10 mittels des kommerziellen Testkits FetoGnost-Kit-RhD, nach der DNA-Isolation durch den Nukleinsäureextraktor QIAsymphony SP, bestimmt. Die Ergebnisse stimmten in allen 186 Fällen mit einem etablierten Referenztest überein. Im Anschluss wurden die Probandinnen nach dem Ergebnis des blutgruppenserologisch bestimmten postnatalen RhD-Status der Neugeborenen befragt. In einer weiterführenden Untersuchung wurde eine Grundgesamtheit von 1403 Frauen im Alter von 16 bis 47 Jahren (Median: 31 Jahre) betrachtet, die sich zum Zeitpunkt der Blutentnahme zwischen der 9. und 38. Schwangerschaftswoche (Median: 20. Schwangerschaftswoche) befanden. Sie wurden ebenfalls nach dem postnatalen RhD-Phänotyp der Neugeborenen befragt. Von insgesamt 1696 Fällen lieferte die NIPT-RhD 1589 eindeutige Ergebnisse, die sich in 998 RhD-positive und 591 RhD-negative Befunde unterteilten. Aus 523 Rückmeldungen zum RhD-Status der Neugeborenen ergab sich eine Sensitivität von 99,68% (95%-Konfidenzintervall: 98,21% – 99,94%, n = 313) und eine Spezifität von 99,05% (95%-Konfidenzintervall: 96,59% – 99,74%, n = 210). Ein falsch negatives Ergebnis ließ sich möglicherweise auf eine lange Transportzeit von sieben Tagen zurückführen, während zwei falsch positive Ergebnisse aus demselben Testlauf stammten, was die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination deutlich erhöht. Insgesamt zeigte sich das FetoGnost-Kit-RhD in Kombination mit dem Nukleinsäureextraktor QIAsymphony SP als präzise und für große Probenserien geeignete Methode zur fetalen RhD-Bestimmung ab der 11+0 Schwangerschaftswoche. Hinsichtlich der diagnostischen Genauigkeit zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Schwangerschaftstrimestern. Die Methode erwies sich ab der 11+0 Schwangerschaftswoche als zuverlässig, während sich bei Proben vor der 8. Schwangerschaftswoche Limitationen zeigten. Längere Transportzeiten führten zu einer signifikant höheren Hämolyse-Rate, da 42 von 45 Proben (93,3%) mit Hämolyse eine Transportzeit von über fünf Tagen aufwiesen, und möglicherweise in einem Fall zu einem falsch negativen NIPT-RhD-Ergebnis. Daher wird auf Grundlage der gewonnenen Daten und im Kontext der Literatur eine maximale Transportzeit von fünf Tagen empfohlen. In 1,2% aller Fälle wurden maternale oder fetale RHD Varianten identifiziert. Das Vorhandensein maternaler RHD Varianten wurde zuverlässig erkannt und führte in zwei Dritteln der Fälle zu einem eindeutigen fetalen RhD-Status auf Grundlage der RHD Exons, die in der maternalen DNA fehlten. Spike-Experimente deuteten darauf hin, dass die Multiplex-PCR hierfür ein sicheres Verfahren sein könnte. Ebenso wurden fetale RHD Varianten zuverlässig erkannt, jedoch ermöglichte die verwendete Methode keine eindeutige Aussage zum RhD-Phänotyp und der Immunogenität. Daher wird bei Nachweis einer fetalen RHD Variante eine Anti-D-Prophylaxe empfohlen. Eine Sequenzierung von DNA fetaler RHD Varianten aus maternalem Plasma mittels Next-Generation-Sequencing war nicht erfolgreich. Eine Lagerung von Plasma von Schwangeren erwies sich bei 4°C für bis zu sieben Tage unproblematisch. Zum Zwecke der internen täglichen Qualitätskontrolle und für Ringversuche kann es bei -20°C mindestens 14 Monate sowie bei -80°C über mindestens 25 Monate gelagert werden.