Prä- und Posthomogenisierungsfärbung mit Antikörpern und Nanokörpern bei X10heat-Expansionsmikroskopie
Pre- and posthomogenization staining with antibodies and nanobodies in X10heat expansion microscopy
by Julia Aden née Julia Miriam Posern
Date of Examination:2026-01-14
Date of issue:2026-01-06
Advisor:Prof. Dr. Silvio O. Rizzoli
Referee:Prof. Dr. Silvio O. Rizzoli
Referee:Prof. Dr. Dörthe Katschinski
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-11728
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Name:Veröffentlichung- Doktorarbeit- Expansionsmi...pdf
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Format:PDF
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Abstract
English
Background: Conventional light microscopy is constrained by the diffraction limit and cannot resolve structures smaller than ~200 nm. Super-resolution microscopy (SRM) techniques such as STED, STORM, PALM, and SIM overcome this barrier but require costly instrumentation and specialized expertise. Expansion microscopy (ExM), introduced in 2015, provides an alternative by embedding biological samples in swellable hydrogels and physically enlarging them, enabling nanoscale imaging with standard microscopes. Classical ExM protocols rely on proteolytic homogenization with Proteinase K, which often leads to fluorophore loss and signal attenuation. Methods: To address this limitation, the X10heat (X10ht) protocol was developed, employing heat-induced homogenization at 100 °C in an alkaline, detergent-rich buffer. In this study, we evaluated the compatibility of various antibody and nanobody combinations with X10ht expansion microscopy in neurons and HEK cells. Both pre-homogenization and post-homogenization staining strategies were tested. Results: Pre-homogenization staining produced robust fluorescent signals across multiple antibody combinations. Post-homogenization staining, while potentially advantageous by avoiding fluorophore degradation, yielded heterogeneous results that depended strongly on antibody heat stability and epitope recognition. Nanobodies, due to their smaller size, offer reduced linkage error and improved localization accuracy, but in this study generated weak fluorescence signals, likely due to limited fluorophore labeling. Conclusion: X10ht expansion microscopy demonstrates significant potential for high-resolution protein imaging using conventional microscopes. The findings highlight both the strengths and current limitations of antibody and nanobody applications within this protocol. Future work should explore optimized staining strategies, including post-expansion labeling, and integration with established SRM methods such as ExSTED, ExSTORM, and ExPALM to further enhance imaging resolution and reliability.
Keywords: Expansion microscopy (ExM); High-resolution microscopy; X10; X10heat-expansion microscopy (X10ht); Pre- and post-homogenization staining; antibodies; nanobodies
German
Hintergrund: Konventionelle Lichtmikroskopie ist durch die Beugungsgrenze des Lichts limitiert und kann Strukturen kleiner als ~200 nm nicht auflösen. Super-Resolution-Mikroskopie (SRM)-Techniken wie STED, STORM, PALM und SIM überwinden diese Grenze, erfordern jedoch kostenintensives Equipment und spezielles Fachwissen. Die 2015 eingeführte Expansionsmikroskopie (ExM) bietet einen alternativen Ansatz, indem biologische Proben in quellbare Hydrogele eingebettet und physikalisch vergrößert werden, sodass hochauflösende Bildgebung mit konventionellen Mikroskopen möglich wird. Klassische ExM-Protokolle basieren auf proteolytischer Homogenisierung mit Proteinase K, was jedoch zu Fluorophorverlust und Signalabschwächung führt. Methoden: Zur Lösung dieses Problems wurde das X10heat-Protokoll (X10ht) entwickelt, das eine hitzeinduzierte Homogenisierung bei 100 °C in einem alkalischen, detergenzienreichen Puffer nutzt. In dieser Arbeit wurden verschiedene Antikörper- und Nanokörper-Kombinationen hinsichtlich ihrer Kompatibilität mit der X10ht-Expansionsmikroskopie an Neuronen und HEK-Zellen untersucht. Dabei wurden sowohl Prähomogenisierungs- als auch Posthomogenisierungsfärbungen getestet. Ergebnisse: Prähomogenisierungsfärbungen lieferten robuste Fluoreszenzsignale über verschiedene Antikörperkombinationen hinweg. Posthomogenisierungsfärbungen, die den Vorteil haben könnten, Fluorophorverlust zu vermeiden, führten zu heterogenen Ergebnissen und hingen stark von der Hitzestabilität der Antikörper sowie der Epitopeerkennung ab. Nanokörper bieten prinzipiell Vorteile durch geringere Verknüpfungsfehler und höhere Lokalisierungsgenauigkeit, zeigten jedoch in dieser Studie schwache Fluoreszenzsignale, vermutlich aufgrund einer geringeren Anzahl gekoppelter Fluorophore. Schlussfolgerung: Die X10ht-Expansionsmikroskopie zeigt großes Potenzial für die hochauflösende Proteinbildgebung mit konventionellen Mikroskopen. Die Ergebnisse verdeutlichen sowohl die Stärken als auch die aktuellen Einschränkungen bei der Anwendung von Antikörpern und Nanokörpern im X10ht-Protokoll. Zukünftige Arbeiten sollten optimierte Färbestrategien, einschließlich Postexpansionsfärbungen, sowie die Kombination mit etablierten SRM-Techniken wie ExSTED, ExSTORM und ExPALM untersuchen, um die Bildauflösung und Signalqualität weiter zu verbessern.
Schlagwörter: Antikörper und Nanokörper; Expansionsmikroskopie; hochauflösende Mikroskopie; X10; X10-heat Expansionsmikroskopie; Prä und post Homogenisierungsfärbung; Antikörper und Nanokörper
