Interplay of the COP9 signalosome deneddylase and the UspA deubiquitinase to coordinate fungal development and secondary metabolism

by Cindy Meister
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-06-06
Date of issue:2019-05-29
Advisor:Prof. Dr. Gerhard H. Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard H. Braus
Referee:Prof. Dr. Kai Tittmann
Referee:Dr. Achim Dickmanns
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7486

 

 

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Abstract

English

Protein half-life is controlled through the ubiquitin-proteasome system (UPS). Proteins are labeled with ubiquitin chains by E3 cullin RING ligases (CRLs) and then degraded by the 26S proteasome. The COP9 signalosome (CSN) is conserved between multicellular fungi and humans and inactivates CRLs by removing the ubiquitin-like protein Nedd8 from the cullin scaffold subunit (deneddylation). The conformational change of the E3 ligase complex allows the exchange of the substrate binding receptor complex. This enables ubiquitin-mediated degradation of different target proteins in response to environmental changes or developmental programs. CSN recognizes CRLs, which are not interacting with substrates. The proteomes of vegetative hyphae of A. nidulans with or without the gene encoding for the catalytically active deneddylase subunit CsnE of the CSN were compared. Therefore stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) was established for this fungus. Relative quantification revealed changes in protein abundances of more than 10 % of the identified proteins. An intact CSN promotes higher protein amounts of developmentally relevant proteins, whereas CSN dysfunction results in increased levels of proteins related to amino acid metabolism. The A. nidulans ubiquitin-specific protease A (UspA) counteracts the UPS by removing ubiquitin chains from proteins. UspA is the ortholog of human Usp15, which interacts with CSN. Gene expression of fungal uspA is reduced in the presence of a functional CSN. UspA interacts with fungal CSN subunits in vivo and in vitro and is primarily localized close to nuclei. The association of UspA to karyopherins and proteins involved in transcriptional processing imply a function during nuclear transport. The UspA cysteine residues C469 and C1066 are essential for its deubiquitination activity. Respective alanine exchanges in the uspAAA mutant allele produce an inactive enzyme resulting in increased levels of ubiquitinated proteins during fungal development similar to the uspA deletion strain. These results suggest a possible protein stabilization function of UspA. An uspA deletion strain forms reduced amounts of asexual conidia and is delayed in sexual fruiting body formation. Destabilization of VeA is observed during wild type development, but not without UspA. The VeA regulator of fungal development and secondary metabolism pulled only in uspA deficient strains the DbaB and DbaH proteins encoded by the derivative of benzaldehyde (dba) secondary metabolite gene cluster. The lack of either functional UspA or CSN results in increased dba gene cluster expression. The location of UspA in proximity to the nucleus, the interaction with various proteins involved in nuclear transport, transcription and protein turnover and the impact on fungal development and secondary metabolism support a complex fine tuning function of the deubiquitinase in the A. nidulans life cycle.
Keywords: Aspergillus nidulans; ubiquitin; deubiquitinating enzymes (DUBs); ubiquitin-proteasome system; COP9 signalosome (CSN); ubiquitin-specific protease; velvet domain proteins

German

Das Ubiquitin-Proteasom System reguliert die Lebensdauer der Proteine einer Zelle. Proteine, die abgebaut werden sollen, werden von E3 Cullin RING Ligasen (CRLs) mit Ubiquitinketten markiert und durch das 26S Proteasom abgebaut. Das COP9 Signalosom (CSN) ist von filamentösen Pilzen bis zum Menschen konserviert und deneddyliert CRLs. Dadurch kann ein Austausch der Rezeptor-Untereinheit stattfinden und es wird sichergestellt, dass je nach Umweltbedingungen oder Entwicklungsstadien spezifische Proteine zum Abbau markiert werden. Das COP9 Signalosom deneddyliert CRLs, die gerade kein Substrat binden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Proteom vegetativer Hyphen in Abhängigkeit von der katalytisch aktiven CSN Untereinheit, CsnE, in Aspergillus nidulans analysiert. Dafür wurde SILAC (stable isotope labeling with amino acids in cell culture) für die Anwendung in dem filamentösen Pilz A. nidulans etabliert. Die relative Quantifizierung von Proteinen ergab, dass die Abundanz von 10 % aller identifizierten Proteine in ΔcsnE im Vergleich zum Wildtyp verändert ist. Ein aktives COP9 Signalosom führt zu erhöhten Mengen von Proteinen, die für die pilzliche Entwicklung relevant sind, während es die Menge an Proteinen des Aminosäuremetabolismus reduziert. Die Ubiquitin-spezifische Protease A (UspA) in A. nidulans wirkt dem Ubiquitinierungsprozess entgegen und schneidet die Ubiquitinketten von den Substraten ab. UspA ist das Ortholog zum menschlichen Usp15. Die Genexpression von uspA ist reduziert, wenn das COP9 Signalosom funktioniert. UspA interagiert mit Untereinheiten des CSNs in vivo und in vitro und ist vorwiegend in der Nähe des Zellkerns lokalisiert. UspA könnte eine Funktion im Kerntransport ausüben, da es mit Karyopherinen sowie Proteinen, die an der Transkription beteiligt sind, interagiert. Die Menge an ubiquitinierten Proteinen wird während der gesamten pilzlichen Entwicklung von UspA reguliert. Dabei sind zwei Cysteine essentiell für die katalytische Aktivität. ΔuspA bildet eine reduzierte Anzahl an Conidiosporen und ist verzögert in der Bildung sexueller Fruchtkörper. VeA, ein Regulator der pilzlichen Entwicklung und des sekundären Metabolismus (SM) wird im Wildtyp nach frühen Entwicklungszeitpunkten abgebaut, während es in ΔuspA über die Zeit akkumuliert. VeA interagiert nur in ΔuspA mit den Proteinen DbaB und DbaH, welche durch das dba (derivative of benzaldehyde) SM Gen-Cluster codiert werden. Defekte im COP9 Signalosom oder in UspA führen zu einer erhöhten Expression der Gene dieses Clusters. Die Lokalisation von UspA in der Nähe des Zellkerns, die Interaktion mit Proteinen, die im Kerntransport, in der Transkription oder in der Proteinstabilität involviert sind sowie der Einfluss von UspA auf die Entwicklung und den SM von A. nidulans ermöglichen eine komplexe Steuerung des pilzlichen Lebenszyklus.
 
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