Funktionelles ROS/Redox Imaging, basierend auf genetisch-kodierten optischen Sensoren, exzitationsratiometrischer Zwei-Photonen-Mikroskopie und Fluoreszenzlebenszeiten

Advanced ROS/Redox Imaging, based on genetically encoded probes, ratiometric 2-Photon-microscopy and fluorescence-lifetime imaging.

by Kathrin Michaela Kizina
Doctoral thesis
Date of Examination:2019-06-27
Date of issue:2019-06-20
Advisor:Prof. Dr. Michael Müller
Referee:Prof. Dr. Stefan Jakobs
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7518

 

 

Files in this item

Name:Dissertation2019-finalpdf.pdf
Size:1.81Mb
Format:PDF

The following license files are associated with this item:

Abstract

English

Reactive oxygen species (ROS) contribute to cellular signaling and neuropathology. There is tremendous interest in quantitative recordings of their celluar dynamics. Previously, organic dyes served to rate ROS formation but they respond irreversibly and report oxidation only. Genetically-engineered optical redox sensors are available, which derive from fluorescent proteins. We characterized roGFP1 and HyPer; both are ratiometric by excitation and respond reversibly to redox challenge. Lipofected mouse hippocampal cell cultures expressed these sensors cytosolically; nuclear counter-labeling confirmed that only HyPer spared the nucleus. 2-photon excitation spectra shows broad absorption for both sensors. Ratiometric 2-photon excitation revealed an increased fluorescence ratio of HyPer upon oxidation by H2O2, but less consistent responses to reduction by DTT. In contrast, the roGFP1 ratio increased upon oxidation and decreases upon reduction. The fluorescence-lifetime imaging of HyPer was decreased by H2O2 but failed to respond reliably to DTT. RoGFP1 responded to oxidation and reduction, showing decreased and increased fluorescence-lifetimes.
Keywords: roGFP1; HyPer

German

Reaktive Sauerstoffspezies beeinflussen Signalwege innerhalb der Zellen und können eine Schädigung der Zellkompatimente hervorrufen. Es besteht ein großes Interesse für die Darstellung der zellulären Dynamik der reaktiven Sauerstoffspezies. Es exsistieren organische Färbungen, die nur auf Oxidation reagieren und sich irreversibel verändern. Die genetisch kodierten Redox-Sensoren hingegen, roGFP1 und HyPer, reagieren reversibel auf Veränderungen des Redox-Status. HyPer ist ein verhältnismäßig großes Molekül und gelangt nur in geringen Konzentrationen in den Zellkern. Für HyPer und roGFP1 existiert jeweils ein breites Exzitationsspektrum. Bei Oxidation mit H2O2 ergibt sich ein Anstieg der Fluoreszenzintensität für HyPer. Eine Reduktion mit DTT bewirkt uneinheitliche Ergebnisse. Im Gegensatz dazu zeigt roGFP1 zuverlässige Reaktionen mit einem Anstieg der Intensität bei Oxidation sowie einer Abnahme bei Reduktion. Die Fluoreszenzlebenszeit von HyPer ist kürzer als die Fluoreszenzlebenszeit von roGFP1. Unter Oxidation (H2O2) zeigt sich für HyPer und roGFP1 eine verkürzte Lebenszeit. Die Fluoreszenzlebenszeit von roGFP1 wird unter Reduktion mit DTT länger, die Fluoreszenzlebenszeit von HyPer unter Reduktion zeigt wiederum uneinheitliche Ergebnisse.
Schlagwörter: roGFP1; HyPer
 
Statistik