Die Regulation des Sulfat-Anionen-Transporters-1, sat-1, in HepG2- Zellen in Abhängigkeit vom pH-Wert und von Bicarbonat

Regulation of sulfate anion transporter-1 in HepG2 cells depending on PH value and bicarbonate

by Jan Helge Saathoff
Doctoral thesis
Date of Examination:2019-12-02
Date of issue:2019-10-14
Advisor:Prof. Dr. Birgitta-Christina Burckhardt
Referee:Prof. Dr. Abdul Rahman Asif
Referee:Prof. Dr. Rainer Mausberg
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7664

 

 

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Abstract

English

Sulfate is an essential component of the human organism and the fourth most abundant anion in the blood. It is involved in numerous metabolic processes like biosynthesis, synthesis of the extracellular matrix and the bone formation. Furthermore it is important for the detoxification of non-soluble waste products and toxins. Upon sulfation in the liver, such waste products are rendered water-soluble and can thus be excreted via the kidney and the bile system. The sulphate-anion exchange transporter sat-1 is responsible for the uptake of sulphate from the bloodstream into hepatocytes and cells of the proximal tubulus. Sat-1 transports sulphate in exchange with oxalate and bicarbonate, and it is the first member of the solute carrier 26 (SLC26A1) gene family. The goal of this study was to analyse the regulation of sat-1 on RNA and protein level in HepG2 cells depending on the pH and the bicarbonate level in the extracellular compartment. To this end quantitative methods like polymerase chain reaction (PCR) and western blotting were used. Changes of the extracellular pH and bicarbonate level may occur if there is a malfunction in the homeostatic system. A time-dependent decrease of the sat-1 mRNA level was observed in incubated HepG2 cells at pH 6.5, whereas at pH 8.0 its level was increasing. Incubating the HepG2 cells in a bicarbonate-enriched medium led to elevated sat-1 mRNA level. Interestingly, the house-keeping / reference-gene GAPDH also showed a pH dependency. Therefore, HPRT was used in a subsequent experiment. An anti-sat-1 antibody was used to detect sat-1 expression. It was thus also shown on protein level that at pH 6.5 the sat-1 expression was reduced when HepG2 cells were incubated at pH 6.5.
Keywords: sulfate-anion exchanger; sulfate-bicarbonate exchanger; HepG2 cells stably transfected with SLC26A1

German

Sulfat ist ein essentieller Bestandteil des menschlichen Organimus und das vierthäufigste Anion im Blut. Es greift in unterschiedliche Prozesse wie die Biosynthese, die Synthese der Zellmatrix und des Knochenaufbaus ein und ist wichtig für die Detoxifikation wasserunlöslicher Abbauprodukte und Schadstoffe. Diese Stoffe werden nach Sulfatierung in der Leber wasser-löslich und können über entsprechende Transportsysteme über die Galle und die Nieren ausgeschieden werden. Für die Aufnahme von Sulfat aus dem Blut in die Hepatozyten und die proximalen Tubuluszellen ist ein Sulfat-Anionen-Transporter, der sat-1, verantwortlich. Er transportiert Sulfat im Austausch gegen Oxalat und Bicarbonat und ist das erste Mitglied der Gen-Familie der Solute Carrier 26 (SLC26A1). In der vorliegenden Studie wurde die Regulation des sat-1 auf RNA- und Protein-Ebene in HepG2-Zellen in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert und der extrazellulären Bicarbonatkonzentration untersucht. Hierzu wurden Methoden der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Western Blots eingesetzt. Veränderungen der extrazellulären Protonen- und Bicarbonat-Konzentration können bei Störungen des Säuren-Basen-Haushalts auftreten. Die Inkubation der HepG2-Zellen bei pH 6,5 führte zeitabhängig zu einer Abnahme und bei pH 8 zu einer Zunahme des sat-1-mRNA-Gehalts. Die Inkubation der HepG2-Zellen in bicarbonathaltigen Medien erhöhte den sat-1-mRNA-Gehalt. Als interessanter Nebenbefund wurde eine pH-Abhängigkeit des house-keeping- bzw. Referenz-Gens GAPDH beobachtet, sodass in einer zweiten Versuchsreihe HPRT als house-keeping-Gen eingesetzt wurde. Ein anti-sat-1-Antikörper detektierte eine geringere sat-1-Expression bei pH 6,5 auch auf Proteinebene und bestätigte die schon in der PCR erzielten Ergebnisse eines geringeren sat-1-mRNA-Gehalts nach Inkubation der HepG2-Zellen bei pH 6,5.
 
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