Towards the identification and functional characterization of Verticillium effectors involved in xylem hyperplasia formation in Arabidopsis

by Leonie Weber
Doctoral thesis
Date of Examination:2019-07-01
Date of issue:2020-05-26
Advisor:Prof. Dr. Volker Lipka
Referee:Prof. Dr. Volker Lipka
Referee:PD Dr. Thomas Teichmann
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Ivo Feußner
Referee:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:Prof. Dr. Andrea Polle
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7968

 

 

Files in this item

Name:DisstertationLW_2019.pdf
Size:9.75Mb
Format:PDF

The following license files are associated with this item:

Abstract

English

Isolates of the vascular plant pathogen Verticillium spp. can be categorized according to the disease phenotypes they induce on Arabidopsis thaliana Col-0 plants (Thole 2016). While Arabidopsis plants show no obvious disease symptoms in response to inoculation with some Verticillium isolates (asymptomatic class), plants infected with wilting-class isolates are characterized by stunted growth and wilting symptoms accompanied by enhanced lignification of xylem elements (Reusche et al. 2014). Chlorosis-class isolates, on the other hand, trigger stunting, chlorosis and developmental reprogramming characterized by transdifferentiation of bundle sheath and xylem parenchyma cells into xylem elements and establishment of xylem hyperplasia (Reusche et al. 2012). The first aim of this thesis was to identify chlorosis-class specific candidate effectors that trigger developmental reprogramming in Arabidopsis. To this end, whole-genome comparison of wilting-class reference isolate V. dahliae JR2 and de novo sequenced chlorosis-class reference isolate V. dahliae V76 was conducted. Comparative genomics revealed V76-specific regions which were subsequently mined for putative effector candidates. Finally, four LINEAGE-SPECIFIC CANDIDATE EFFECTORs (LSCEs) were identified. LSCE2 was selected as the primary candidate for further investigation due to its high transcriptional induction in planta. Sequence analyses revealed two identical copies of LSCE2 in the genomes of haploid chlorosis-class reference isolates V. dahliae V76 and chlorosis-class allodiploid V. longisporum VL43. Furthermore, it was demonstrated that LSCE2 is located in a ~ 20 kb tandem-inverted LSCE region in both isolates. In total, six genes were predicted to be encoded in the LSCE region, including the transposable element-associated enzymes reverse transcriptase and a transposase. It was therefore hypothesized that transposable elements were involved in the evolution of the LSCE region. Analyses of a set of 15 V. dahliae and 10 V. longisporum isolates from all infection classes confirmed that LSCE2 is present exclusively in chlorosis-class isolates. In addition, it was demonstrated that all Verticillium spp. isolates harbor a single-copy homolog of LSCE2, here designated LSCE2-like, in their core genome. It is likely that LSCE2 arose from duplication and subsequent neofunctionalization from LSCE2-like. Next, it was investigated if LSCE2 is involved in the establishment of the chlorosis-class disease phenotype. To this end, LSCE2 single and double knockout lines in the V. dahliae V76 and V. longisporum VL43 background were generated. In addition, LSCE2 was expressed ectopically in the wilting-class reference isolate V. dahliae JR2. Deletion of both LSCE2 copies completely abolished chlorosis-class disease symptoms on Arabidopsis. Concomitantly, transgenic expression conferred the ability to induce chlorosis-class disease symptoms to V. dahliae JR2. Consequently, it can be postulated that the effector LSCE2 mediates developmental reprogramming of Arabidopsis in chlorosis-class Verticillium spp. infections. To further characterize protein properties of LSCE2, a His-tagged version of the protein was expressed and purified using the Pichia pastoris expression system and affinity chromatography. Remarkably, transdifferentiation and chlorosis were observed after infiltration of Arabidopsis leaves with the purified protein. In addition, Arabidopsis lines stably expressing the fluorescence-tagged fusion protein LSCE2-GFP were generated. Transgenic lines with different expression levels of LSCE2-GFP showed dosage-dependent induction of stunting, chlorosis and transdifferentiation of bundle sheath cells. Taken together, this work demonstrates that a single lineage-specific Verticillium effector molecule, LSCE2, induces the complex cell-type specific developmental reprogramming patterns characteristic for chlorosis-class Verticillium infections.
Keywords: Verticillium

German

Isolate des vaskulären Pflanzenpathogens Verticillium spp. können anhand des Krankheitsphänotyps den sie bei Arabidopsis thaliana Col-0 auslösen kategorisiert werden (Thole 2016). Während Arabidopsis keine offensichtlichen Krankheitssymptome bei Inokulierung mit manchen Verticillium-Isolaten zeigt (Asymptomatische Klasse), bilden Pflanzen die mit Welke-Klasse Isolaten infiziert sind verkümmertes Wachstum und Welkesymptome aus, die von verstärkter Lignifizierung von Xylemelementen begleitet werden (Reusche et al. 2014). Isolate der Chlorose-Klasse, andererseits, lösen verkümmertes Wachstum, Chlorose und entwicklungsorientierte Umprogrammierung charakterisiert durch Transdifferenzierung von Bündelscheiden- und Xylemparenchymzellen zu Xylemelementen sowie die Etablierung von Xylemhyperplasie (Reusche et al. 2012). Das erste Ziel dieser Dissertation war die Identifizierung von Chlorose-Klasse spezifischen Effektorkandidaten, die die entwicklungsorientierte Umprogrammierung in Arabidopsis auslösen. Dazu wurde ein Genomvergleich von Welke-Referenzisolat V. dahliae JR2 und dem de novo sequenzierten Chlorose-Isolat V. dahliae V76 durchgeführt. Vergleichende Genomanalysen offenbarten V76-spezifische Regionen die daraufhin auf potentielle Effektorkandidaten untersucht wurden. Abschließend wurden vier Effektorkandidaten, „LINEAGE-SPECIFIC CANDIDATE EFFECTORs” (LSCEs), identifiziert. LSCE2 wurde wegen seiner hohen transkriptionellen Induktion in planta als primärer Kandidat für weitere Untersuchungen ausgewählt. Sequenzanalysen zeigten das Vorhandensein von zwei identischen Kopien in den Genomen des haploiden Chlorose-Isolats V. dahliae V76 sowie des allodiploiden Chlorose-Isolats V. longisporum VL43. Es wurde zudem gezeigt, dass LSCE2 in beiden Isolaten in einer ~20 kb tandem-invertierten LSCE-Region lokalisiert ist. Insgesamt wurde die Kodierung von sechs Genen in der LSCE-Region bestimmt, darunter die Transposon-assoziierten Enzyme Reverse Transkriptase und Transposase. Es wurde hierauf die Hypothese aufgestellt, dass Transposons in der Evolution der LSCE-Region beteiligt waren. Analysen einer Gruppe von 15 V. dahliae- und 10 V. longisporum-Isolaten aller Infektionsklassen bestätigten, dass LSCE2 exklusiv in den Genomen von Chlorose-Isolaten vorhanden ist. Zudem wurde gezeigt, dass alle Verticillium spp.-Isolate ein Einzelkopie-Homolog zu LSCE2, hier LSCE2-like benannt, in ihrem Genom besitzen. In aller Wahrscheinlichkeit entstand LSCE2 durch Duplikation und darauffolgender Neofunktionalisierung aus LSCE2-like. Als nächstes wurde untersucht, ob LSCE2 in der Etablierung des Chlorose-Klassen spezifischen Krankheitsphänotyps involviert ist. Dazu wurde LSCE2 einzeln und doppelt in V. dahliae V76 und V. longisporum VL43 deletiert. Zusätzlich wurde LSCE2 ektopisch im Welke-Referenzisolat V. dahliae JR2 exprimiert. Die Deletion beider LSCE2-Kopien führte zu einer kompletten Aufhebung der Chlorose-Klassen spezifischen Krankheitssymptome auf Arabidopsis. Gleichzeitig übertrug die transgene Expression von LSCE2 die Fähigkeit, Chlorose-Klasse Symptome auszulösen auf V. dahliae JR2. In Konsequenz kann postuliert werden, dass der Effektor LSCE2 die entwicklungsorientierte Umprogrammierung von Arabidopsis bei Infektion mit Chlorose-Klassen Verticillium spp. vermittelt. Um weiterführend die Eigenschaften des LSCE2-Proteins zu charakterisieren, wurde eine His-getaggte Version des Proteins im Pichia pastoris Expressionssystem exprimiert und mittels Affinitätschromatographie aufgereiningt. Bemerkenswerterweise wurden Transdifferenzierung und Chlorose nach Infiltration von Arabidopsisblättern mit aufgereinigtem Protein beobachtet. Zusätzlich wurden Arabidopsislinien generiert, die das Fluoreszenz-getaggte Fusionsprotein LSCE2-GFP stabil exprimieren. Transgene Linien mit unterschiedlichen Expressionsleveln von LSCE2-GFP zeigten eine dosierungsbedingte Induktion von verkümmertem Wachstum, Chlorose und Transdifferenzierung von Bündelscheidenzellen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass ein einzelnes Klassen-spezifisches Verticillium Effektormolekül, LSCE2, die komplexen, zelltypspezifischen Umprogrammierungsmuster induziert, die für Infektionen mit Chlorose-Klassen Verticillium Isolaten charakteristisch sind.
 
Statistik