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Multiplexe optische und Rasterkraftmikroskopie für biomedizinische Bildgebung

dc.contributor.advisorRizzoli, Silvio O. Prof. Dr.
dc.contributor.authorMittelmeier, Lucas
dc.date.accessioned2020-07-03T05:32:00Z
dc.date.available2020-07-14T22:50:04Z
dc.date.issued2020-07-03
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0005-13FB-B
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-8066
dc.language.isodeude
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc610de
dc.titleMultiplexe optische und Rasterkraftmikroskopie für biomedizinische Bildgebungde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedMultiplex optical and Atomic Force Microscopy for biomedical imagingde
dc.contributor.refereeRizzoli, Silvio O. Prof. Dr.
dc.date.examination2020-07-07
dc.description.abstractgerDie Funktion oder Fehlfunktion eines Organismus hängen entscheidend von der Gesamtheit seiner exprimierten Proteine ab, dem Proteom. Forschung und angewandte Medizin sind daher zunehmend an der Entwicklung von Verfahren interessiert, die nicht nur eines - sondern mehrere Proteine simultan - präzise bestimmen können. Innerhalb der multiplexen Verfahren finden besonders Immunoassays große Verbreitung, da Antikörper hervorragende spezifische Bindungseigenschaften besitzen. In den letzten Jahrzehnten finden allerdings zunehmend Nanobodys Verwendung, die als rekombinante und kleinere Alternative einige Vorteile versprechen. Der proof of principle eines innovativen und multiplexen Bildgebungsverfahrens mittels Nanobodys ist daher Gegenstand dieser Arbeit. Um die Voraussetzung für multiplexe Bildgebung in Zellen zu schaffen, sollte zuerst die Expression von bis zu 15 künstlichen Proteinen in einer Zellpopulation erreicht werden. Es wurden HEK293-Zellen eingesetzt, in denen per Transfektion gezielt zu diesem Zwecke entworfene Proteinkonstrukte exprimiert wurden. Hierzu wurden drei verschiedene Ansätze getestet: Die Fusion transfizierter Zellen, die Anwendung von 2A-Sequenzen und das eigens zu diesem Zwecke entworfene Co-Seeding. Das Co-Seeding erwies sich als geeignetste Methode. Die hier genutzten Proteinkonstrukte bestanden aus einem Kernprotein und angehängten Epitopen, die als Marker fungieren. Diese Epitop-Marker kodieren in eindeutiger Weise jedes Protein und werden auch „Nanostamps“ genannt. Mithilfe von Nanobodys, die gegen besagte Epitope gerichtet waren, konnte in immunfluoreszenter Bildgebung anschließend die Identifizierung der Proteine anhand ihres Epitop-Codes vorgenommen werden. Die Auswertung kann von einer automatischen digitalen Bildanalyse übernommen werden. Eine solche Bildgebung verspricht die Einsparung von Kosten und Zeit für die Entwicklung neuer Liganden, in diesem Fall Nanobodys, gerade wenn hohe Zahlen an Analyten gefordert sind. Um in Zukunft eine Bildgebung in hoher Auflösung im nm-Bereich und unabhängig von den Limitierungen Fluoreszenz-abhängiger Verfahren zu ermöglichen, wurde im Rahmen dieser Arbeit außerdem die Anwendung eines Rasterkraftmikroskops (Atomic Force Microscope, AFM) erprobt. Im späteren Verlauf des Projektes soll ein Transfer unserer - im immunhistochemischem Bereich nun erprobten - Methode auf diese vielversprechende Technologie vorgenommen werden.de
dc.description.abstractengFunction or malfunction of an organism highly depend on the variety of its expressed proteins, the so-called Proteom. Science and clinical medicine have become increasingly interested in methods which precisely detect not only one, but multiple types of protein simultaneously. Since antibodies provide high specificity and affinity, immunoassays find broad application within the field of multiplex methods. Additionally, in recent centuries the use of nanobodies has spread, promising a recombinant and smaller alternative to antibodies. Scope of this thesis was providing a proof of principle for an innovative and multiplex imaging method using nanobodies. First, in order to create an environment for multiplex imaging in cells, expression of up to 15 artificial proteins in a population of cells had to be achieved. We transfected HEK293-cells with protein constructs designed exclusively for this purpose. Three approaches were tested: Fusion of transfected cells, application of 2A-sequences and Co-Seeding. Co-Seeding was proven to be the most suitable method. The artificial proteins used for this method consist of a core protein as well as one to four epitope tags. These epitope tags, called "Nanostamps", code for each protein in a definite way. Using nanobodies against said epitopes, we could later identify each protein based on it's unique epitope code in immunofluorescent focal imaging. Image interpretation was further enhanced by implementation of image analysis algorithms. In summary, this method promises reduction of time and cost for the development of new ligands, especially where detection of numerous analytes are required. In addition to these findings, in order to enable high-resolution imaging in nm-range independent of fluorescence-related limitations, first steps towards the application of Atomic Force Microscopy (AFM) were taken. In future stages of the project, our method could be transferred to this promising imaging technology.de
dc.contributor.coRefereeThoms, Sven PD Dr.
dc.subject.gerNanobodyde
dc.subject.gerAFMde
dc.subject.germultiplexde
dc.subject.gerBildgebungde
dc.subject.engAFMde
dc.subject.engmultiplexde
dc.subject.engnanobodyde
dc.subject.engimagingde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0005-13FB-B-5
dc.date.embargoed3000-12-31
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.subject.gokfullBiochemie / Physiologische Chemie / Pathobiochemie - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619875313)de
dc.description.embargoed2020-07-14
dc.description.embargoedunknown
dc.identifier.ppn1703461916


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