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Untersuchung spezifischer Inhibitoren der PI3K-Signalkaskade zur Therapie des Lymphangioms

dc.contributor.advisorWilting, Jörg Prof. Dr.
dc.contributor.authorBlesinger, Hannah Leonore
dc.date.accessioned2020-07-06T14:23:52Z
dc.date.available2020-07-27T22:50:04Z
dc.date.issued2020-07-06
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0005-13FF-7
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-8046
dc.language.isodeude
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc610de
dc.titleUntersuchung spezifischer Inhibitoren der PI3K-Signalkaskade zur Therapie des Lymphangiomsde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedInvestigation of specific inhibitors of the PI3K signal cascade for the therapy of lymphangiomade
dc.contributor.refereeWilting, Jörg Prof. Dr.
dc.date.examination2020-07-20
dc.description.abstractgerLymphatische Malformationen (LM; Lymphangiome) sind gutartige kongenitale Fehlbildungsstörungen des Lymphgefäßsystems und zeichnen sich durch zystische Lymphgefäßerweiterungen aus. Dabei unterscheidet man die makrozystische, mikrozystische und gemischte Form der LM. Die LM treten vor allem im Kopf-, Mund-und Halsbereich auf, sind aber auch an Rumpf, Extremitäten und im Mediastinum zu finden. Die Zysten sind dabei mit Lymphendothelzellen (LEC) ausgekleidet, welche typische Endothel-(CD31, VE-Cadherin) und Lymphendothelzellmarker (Podoplanin, PROX1, LYVE-1) exprimieren. Die Therapiemöglichkeiten umfassen vor allem die chirurgische Resektion und Sklerosierung der betroffenen Stellen. Eine kausale Standardtherapie gibt es bislang noch nicht. Allerdings haben kürzlich durchgeführte Studien gezeigt, dass sich in LM-Proben aktivierende Mutationen der katalytischen α-UE des PIK3CA-Gens (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha) befinden. Im Seattle Children’s Hospital wurde LM-Gewebe von 31 Patienten auf aktivierende PIK3CA-Mutationen untersucht. Dabei zeigten sich bei 74 % der Betroffenen spezifische Mutationen, typischerweise in Exon 8, 10 oder 21. Der genaue Zelltyp, in dem die Mutationen vorkamen, wurde aber nicht bestimmt. Am Institut für Anatomie und Zellbiologie der UMG wurde LM-Gewebe von fünf Patienten in Kultur genommen. Aus dem LM-Gewebe wurden LECs und Fibroblasten isoliert und getrennt kultiviert. Frau Dr. S. Kaulfuß aus dem Institut für Humangenetik der UMG untersuchte die Zellen auf PIK3CA-Mutationen in den Exons 8, 10 und 21. Es zeigten sich bei vier von fünf LEC-Proben typische aktivierende, monoallelische PIK3CA-Mutationen; in den Fibroblasten waren keine Mutationen nachweisbar. In einer Zelllinie (Ly-LEC2) fand sich eine Deletion in Exon 2 (Glu109del), nicht jedoch in den Fibroblasten des Patienten. Neben dem LM-Gewebe wurden auch Lymphendothelzellen von juvenilen Spendern (PromoCell, Heidelberg) untersucht. Es fanden sich keine Mutationen in den Exons 8, 10 und 21 der PIK3CA. In den durchgeführten Proteinnachweisversuchen (Western Blot) konnte eine deutlich verstärkte Expression von pAKT in den Zelllinien Ly-LEC1, Ly-LEC2 und Ly-LEC12 im Gegensatz zu den gesunden Zelllinien HD-LEC C3 und HD-LEC C4 nachweisen werden. Dies zeigt, dass der PI3K-AKT-mTOR-Signalweg in den mutierten LECs hoch aktiviert ist. 74 Um die Proliferation der gesunden HD-LECs und der mutierten Ly-LECs zu bestimmen und den Einfluss von Inhibitoren zu testen, wurden Proliferationsassays an sechs LEC-Linien (drei gesunde vs. drei kranke) über 72 h durchgeführt. Dabei wurde durch spezifische Inhibitoren der PIK3CA und der downstream liegenden Kinasen mTOR und AKT, sowie weiterer Tyrosinkinasen versucht, die Proliferation der Ly-LEC spezifisch zu hemmen. Ziel ist es, mit Inhibitoren, die das Wachstum und die Angiogenese der Ly-LEC In-vitro inhibieren, ein therapeutisches Fenster für die Behandlung der LM-Patienten zu finden. Die Proliferationsversuche zeigen zum Teil unterschiedliche und zum Teil gleichartige Wirkungen der acht verschiedenen Inhibitoren auf die gesunden LECs und die LM-LECs. Folgende Inhibitoren wurden in der vorliegenden Arbeit getestet: PI3K-Inhibitoren -Wortmannin, BKM120, LY294002, CAL-101; mTOR-Inhibitor -Rapamycin; AKT-Inhibitor -MK-2206 und die Kinase-Inhibitoren -Dasatinib und Sorafenib. Rapamycin hemmt das Zellwachstum als einziger Inhibitor in beiden verwendeten Konzentrationen im Nanomolarbereich stets hoch signifikant im Vergleich zur Lösungsmittel-Kontrolle (DMSO). Bei den anderen Inhibitoren hemmt die höher verwendete Konzentration (im Mikromolarbereich) in fast allen Fällen die Zelllinien signifikant im Vergleich zur DMSO-Kontrolle (Ausnahme LY294002 bei Ly-LEC2; CAL-101 bei Ly-LEC2 und HD-LEC C2, Sorafenib bei HD-LEC C3). Bei der geringeren Konzentration kommt es zu keiner signifikanten Inhibition (Ausnahme BKM120 bei Ly-LEC12 und HD-LEC C2; MK-2206 bei Ly-LEC12, HD-LEC C2 und HD-LEC C4; Sorafenib bei Ly-LEC1 und HD-LEC C2). Es zeigte sich im Allgemeinen keine eindeutig spezifische Inhibition der LM-LECs (Ly-LECs) ohne die Beeinflussung der gesunden HD-LECs. Einzig bei MK-2206 war eine Reduktion der mutierten LECs unter den Ausgangswert zu beobachten, was bei den gesunden LECs nicht der Fall war. Eine Inhibition der Proliferation der Lymphendothelzellen durch PI3K-/ mTOR-/ AKT-bzw. Tyrosinkinaseinhibitoren ist in einer gewissen Konzentration möglich. Allerdings beeinflussen die Inhibitoren die Proliferation von sowohl LM-LECs als auch gesunden LECs. Ob die Befunde der Untersuchungen direkt auf die In-vivo-Situation übertragen werden können, wird diskutiert. Eine Behandlung von LM-Patienten, wie sie mit Rapamycin nun bereits stattfindet, sollte auf jeden Fall streng und engmaschig kontrolliert werden.de
dc.description.abstractengLymphatic malformations (LM; lymphangiomas) are benign congenital malformation disorders of the lymphatic system and are characterized by cystic lymphatic enlargements. A distinction is made between the macrocystic, microcystic and mixed forms of LM. The LM occur mainly in the head, mouth and neck area, but can also be found on the trunk, extremities and in the mediastinum. The cysts are lined with lymph endothelial cells (LEC), which express typical endothelium (CD31, VE Cadherin) and lymph endothelial cell markers (podoplanin, PROX1, LYVE 1). The main therapeutic options include surgical resection and sclerotherapy of the affected areas. So far, there is no causal standard therapy. However, recent studies have shown that there are mutations activating the catalytic α subunit of the PIK3CA gene (phosphatidylinositol 4.5 bisphosphate 3 kinase catalytic subunit alpha) in LM samples. At Seattle Children's Hospital, LM tissue from 31 patients was examined for activating PIK3CA mutations. 74% of those affected showed specific mutations, typically in exon 8, 10 or 21. The exact cell type in which the mutations occurred was not determined. The Institute of Anatomy and Cell Biology at the UMG, LM tissue was taken from five patients in culture. LECs and fibroblasts were isolated from the LM tissue and cultured separately. Dr. S. Kaulfuß from the Institute of Human Genetics (UMG) examined the cells for PIK3CA mutations in exons 8, 10 and 21. Typical activating, monoallelic PIK3CA were found in four of five LEC samples mutations; no mutations were detectable in the fibroblasts. In one cell line (Ly-LEC2) there was a deletion in exon 2 (Glu109del), but not in the patient's fibroblasts. In addition to the LM tissue, lymph endothelial cells from juvenile donors (PromoCell, Heidelberg) were also examined. There were no mutations in exons 8, 10 and 21 of the PIK3CA. In the protein detection experiments carried out (Western blot), a significantly increased expression of pAKT in the cell lines Ly-LEC1, Ly-LEC2 and Ly-LEC12 could be demonstrated in contrast to the healthy cell lines HD-LEC C3 and HD-LEC C4. This shows that the PI3K AKT mTOR signaling pathway is highly activated in the mutated LECs. In order to determine the proliferation of the healthy HD-LECs and the mutated Ly-LECs and to test the influence of inhibitors, proliferation assays were carried out on six LEC-lines (three healthy vs. three sick) over 72 h. Specific inhibitors of PIK3CA and the downstream kinases mTOR and AKT, as well as other tyrosine kinases, were used to specifically inhibit the proliferation of the Ly-LEC. The aim is to find a therapeutic window for the treatment of LM patients with inhibitors that inhibit the growth and angiogenesis of Ly - LEC in vitro. The proliferation experiments show partly different and partly similar effects of the eight different inhibitors on the healthy LECs and the LM-LECs. The following inhibitors were tested in the present work: PI3K inhibitors - Wortmannin, BKM120, LY294002, CAL-101; mTOR inhibitor - rapamycin; AKT inhibitor – MK-2206 and the kinase inhibitors - dasatinib and sorafenib. Rapamycin inhibits cell growth as the only inhibitor in both concentrations used in the nanomolar range in a highly significant way compared to the solvent control (DMSO). In the case of the other inhibitors, the higher concentration used (in the micromolar range) inhibits the cell lines significantly in almost all cases in comparison to the DMSO control (exception LY294002 with Ly-LEC2; CAL-101 with Ly-LEC2 and HD-LEC C2, sorafenib at HD-LEC C3). At the lower concentration there is no significant inhibition (exception BKM120 for Ly-LEC12 and HD-LEC C2; MK-2206 for Ly-LEC12, HD-LEC C2 and HD-LEC C4; sorafenib for Ly-LEC1 and HD-LEC C2). In general, there was no clearly specific inhibition of the LM-LECs (Ly-LECs) without influencing the healthy HD-LECs. Only with MK-2206 was there a reduction in the mutated LECs below the initial value, which was not the case with the healthy LECs. Inhibition of the proliferation of the lymphatic endothelial cells by PI3K-/ mTOR-/ AKT- or tyrosine kinase inhibitors is possible in a certain concentration. However, the inhibitors affect the proliferation of both LM LECs and healthy LECs. It is discussed whether the findings of the investigations can be transferred directly to the in vivo situation. Treatment of LM patients, as is already taking place with rapamycin, should be strictly and closely monitored.de
dc.contributor.coRefereeStröbel, Philipp Prof. Dr.
dc.contributor.thirdRefereeMausberg, Rainer Prof. Dr.
dc.subject.engPI3Kde
dc.subject.engLymphatic malformationde
dc.subject.engPIK3CAde
dc.subject.engLymphangiomade
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0005-13FF-7-2
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.subject.gokfullMED291de
dc.subject.gokfullMED292de
dc.description.embargoed2020-07-27
dc.identifier.ppn1703803094


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