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Evaluation des Antwortverhaltens des genetisch kodierten optischen Redox-Indikators HyPer

dc.contributor.advisorMüller, Michael Prof. Dr.
dc.contributor.authorWeller, Jonathan
dc.date.accessioned2020-07-07T13:37:18Z
dc.date.available2020-07-07T13:37:18Z
dc.date.issued2020-07-07
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0005-1407-D
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-8079
dc.language.isodeude
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc610de
dc.titleEvaluation des Antwortverhaltens des genetisch kodierten optischen Redox-Indikators HyPerde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedEvaluation of the response properties of the genetically encoded optical redox-sensor HyPerde
dc.contributor.refereeMüller, Michael Prof. Dr.
dc.date.examination2020-06-25
dc.description.abstractgerSauerstoffradikale, auch reaktive Oxygen-Spezies (ROS) genannt, spielen sowohl in der Entstehung neurologischer Erkrankungen als auch in der Zellkommunikation eine bedeutende Rolle. Daher besteht ein enormes Interesse daran, Redox-Prozesse auf subzellulärer Ebene besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurde der genetisch kodierte optische H2O2-Sensor HyPer in primären Hippocampuskulturen von Mäusen in Bezug auf sein Antwortverhalten untersucht. Zwei Tage nachdem die Sensor-DNA mittels Lipofektion in die Zellen eingebracht wurde, wiesen Neurone und Gliazellen eine ausreichende HyPer-Expressionsdichte auf. Der Sensor reagierte auf H2O2 Applikationen reversibel und konzentrationsabhängig. Damit ist er den klassischen synthetischen oxidationssensitiven Farbstoffen eindeutig überlegen. Mehrmalige Applikationen gleicher H2O2- Konzentrationen führten jedoch zu einer stetigen Abnahme der Sensorantwort. Dies war sowohl bei millimolaren als auch bei mikromolaren Konzentrationen der Fall. Hinzu kommt, dass HyPer bei der einmaligen Applikation von H2O2 in millimolarer Konzentration noch in Anwesenheit des Oxidationsmittels eine Abnahme des Fluoreszenzratio zeigt. Obwohl HyPer als H2O2 spezifisch beschrieben wird, reagierte es offenbar auch auf andere Oxidationsmittel sowie auf eine Erhöhung der endogenen Superoxidproduktion. Propionat induzierte pH-Wert-Veränderungen des Cytosols hatten ebenfalls einen merklichen Effekt auf die Fluoreszenzratio. So zeigte HyPer eine scheinbare Reduktion bei Azifikation und eine scheinbare Oxidation bei Alkalsierung. Dieser pH-Wert bedingte Effekt auf den Sensor konnte mittlerweile bei nachfolgenden Untersuchungen mittels des pH-Sensors SypHer eindeutig bewiesen werden. Anoxie und Reoxigenierung führten zu biphasischen Ratio-Verschiebungen im Sinne einer Reduktion gefolgt von einer Oxidation. Anoxie bedingte pH-Wert-Verschiebungen erhöhten die ratiometrischen Antworten. Deutliche Veränderung der Chloridkonzentration hatten kaum einen Effekt auf den Sensor. In den Mitochondrien exprimiertes HyPer reagierte in gleicher Art und Weise auf H2O2 Applikationen. Im Durchschnitt fielen die mitochondrialen Antworten allerdings geringer aus. Dies ist durch längere Diffusionswege, eine weitere Membranbarriere sowie gegebenenfalls auch durch eine stabilere Redoxhomöstase der Mitochondrien-Matrix zu erklären. Schlussfolgernd sind die mit HyPer erlangten Ergebnisse aufgrund seiner pH-Sensibilität, der mangelnden Reaktion auf Reduktionsmittel und der Adaption auf mehrfache Applikation von Oxidationsmittel mit Bedacht zu interpretieren. Zur Vermeidung von Fehlinterpretationen ist es essenziell, die durchgeführten Versuche mit einem pH-Sensor wie z. B. SypHer zu überwachen.de
dc.description.abstractengOxygen radicals, also known as reactive oxygen species (ROS), play a significant role in neurological diseases and in cell communication. Therefore, there is a tremendous interest in monitoring (sub)cellular redox conditions. Here the response properties of the genetically encoded optical H2O2 sensor HyPer in mouse hippocampal cell cultures are evaluated. Two days after lipofection, neurons and glial cells showed sufficient expression levels of HyPer. Upon H2O2 exposure the sensor is reversible and dose dependent. Therefore, HyPer seems to have an advantage compared to the classical synthetic small-molecule dyes. However, repeating applications of the same H2O2 concentration led to a progressively decreasing response. This was shown for H2O2 in the millimolar but also micromolar range. When treated with millimolar concentrations of H2O2, HyPer recovered while H2O2 was still present. Although HyPer is described as H2O2 specific, it apparently responded to other oxidizing agents and an altered cell-endogenous superoxide production. Propionate induced pH-changes in the cytosol also had a significant effect on the fluorescence ratio. The fluorescence signal of HyPer showed an apparent reduction caused by azification and an apparent oxidation during alkalization. Further experiments with the pH-Sensor SypHer have proven the pH sensitivity of HyPer. Anoxia and reoxygenation led to a biphasic ratio shift of a reduction followed by an oxidation. Anoxia-related pH shifts led to the ratiometric answers. Changes in the chloride concentration had hardly any effect on the sensor. In addition, HyPer expressed in the mitochondria reacted the same way to H2O2 applications. On average the mitochondrial responses were less pronounced. This might due to longer diffusion pathways, an additional membrane barrier as well as a more stable redox homeostasis of the mitochondrial matrix. In conclusion, the results obtained with HyPer should be interpreted with caution due to its pH-sensitivity, the lack of response to reducing agents and adaptation to multiple applications. To avoid misinterpretations, experiments should be monitored with a pH sensor such as SypHer.de
dc.contributor.coRefereeJakobs, Stefan Prof. Dr.
dc.subject.gerHyPerde
dc.subject.gerreaktive Oxygen-Speziesde
dc.subject.engHyPerde
dc.subject.engRedoxsignalingde
dc.subject.engOxidative stressde
dc.subject.engReactive oxygen speciesde
dc.subject.engFree radicalsde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0005-1407-D-1
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.subject.gokfullMedizin (PPN619874732)de
dc.identifier.ppn1707310866


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