Design strategies for carbon nanotube-based biosensors

von Florian Alexander Mann
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2020-06-04
Erschienen:2020-07-09
Betreuer:Dr. Sebastian Kruss
Gutachter:Prof. Dr. Martin Suhm
Gutachter:Prof. Dr. Claudia Steinem
Gutachter:Prof. Dr. Silvio O. Rizzoli
Gutachter:Prof. Dr. Silvio O. Rizzoli
Zum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8073

 

 

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Format:PDF
Description:PhD Thesis

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Zusammenfassung

Englisch

Global health crises such as the COVID-19 pandemic clearly show the need for novel and better diagnostic and therapeutic tools. Additionally, understanding underlying molecular processes is crucial. However, current methods face several problems including e.g. the specificity and spatiotemporal resolution of biomarker detection or in vivo targeting of drug delivery vehicles. Single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) are all-carbon nanoparticles with the potential to tackle these challenges. They emit near-infrared (NIR) light (> 900 nm), which leads to three distinct advantages. First, NIR light can be used for enhanced in vivo fluorescence imaging with reduced background and deeper tissue penetration. Second, their NIR fluorescence does not bleach or blink enabling continuous monitoring over long time scales (hours to days). Third, the light emission is responsive to its chemical environment, which in combination with the SWCNT’s large surface area promises high-sensitivity optical sensors for e.g. disease biomarkers. However, these beneficial optical properties can only be utilized when the all-carbon surface is chemically modified to generate selectivity either for biomarker detection or for targeting the SWCNTs to the desired place of action (e.g. cellular receptors). This thesis provides new design strategies for SWCNT-based fluorescent biosensors and is organized according to the nature of conjugation (covalent/non-covalent) and the type of the conjugated biomolecule (DNA, peptide, protein). In the first part, the SWCNTs were non-covalently functionalized with different DNA sequences. It has been known that such SWCNT/DNA hybrids show a fluorescence increase in the presence of the important neurotransmitter dopamine. Here, the correlation between sequence and sensitivity/selectivity was quantified leading to dissociation constants (Kd = 2.3 nM - 9.4 μM) and allowing the detection of dopamine in the presence of structurally similar neurotransmitters such as norepinephrine. In the second part, such SWCNT/DNA-based dopamine sensors were modified with small antibody fragments (nanobodies) lending the required specificity to create targeted dopamine sensors. These targeted sensors were not only fully characterized in vitro, but also applied in vivo in embryos of Drosophila melanogaster for deep-tissue NIR immunofluorescence imaging of the spindle apparatus. Furthermore, this new tool allowed for the first time tracking of a single Kinesin motor protein inside a living organism giving rise to deeper understanding of important intracellular processes as e.g. the velocity a motor protein is moving at in vivo (v = 610 ± 330 nm s-1). To expand the structural possibilities for SWCNT modification, peptidic barrels were introduced as a new molecular entity encapsulating SWCNTs with matching diameter. This new strategy, where de novo designed peptide barrels can be chosen to cover the corresponding SWCNT species, allows not only for chirality enrichment, but also for the subsequent attachment of functional units with applications in targeting or fluorescence microscopy. In the last part, two new so-called quantum defects were introduced into SWCNTs generating an anchor site for subsequent covalent functionalization. In contrast to other covalent functionalization approaches, quantum defects create red-shifted emission features corresponding to exciton traps, but do not quench the SWCNT’s NIR fluorescence. By combining this photophysical advantage with anchor groups for protein attachment and peptide growth, it was possible to generate functional, NIR-fluorescent and covalent SWCNT-Nanobody conjugates, multi-color SWCNTs as well as SWCNT-Peptide hybrids. With the superior stability of covalent chemistry, these anchor-quantum-defects can now be used as a platform technology for the generation of NIR-fluorescent tools for biosens- ing or immunofluorescence microscopy. In summary, these four different parts report fundamental insights into SWCNT surface chemistry and its impact on the photophysical properties. Furthermore, it shows the potential of SWCNTs as building blocks for the generation of new SWCNT-based optical sensors, NIR-tools for fluorescence microscopy or vehicles for targeted delivery under continuous NIR optical monitoring ultimately generating new options for detection and/or treatment of diseases.
Keywords: Nanotube; Carbon; Peptide; Protein; Sensor

Deutsch

Globale Gesundheitskrisen wie die COVID-19-Pandemie zeigen deutlich den Bedarf an neuartigen und besseren diagnostischen und therapeutischen Instrumenten. Darüber hinaus ist das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Prozesse von entscheidender Bedeutung. Existierende Methoden haben jedoch in einigen Bereichen Defizite, insbesondere im Hinblick auf die Spezifität und das Auflösungsvermögen der Detektion sowie den zielgerichteten Transport von Medikamenten. Einwandige Kohlenstoffnanoröhren (single-walled carbon nanotubes, SWCNTs) sind reine Kohlenstoff-Nanopartikel, die das Potenzial haben, diese Herausforderungen zu bewältigen. Sie emittieren Licht im nahen Infrarot (NIR, > 900 nm), was zu drei deutlichen Vorteilen führt. Erstens kann NIR-Strahlung für verbesserte in vivo-Fluoreszenz-Bildgebung mit reduziertem Hintergrund und tieferer Gewebepenetration verwendet werden. Zweitens ist die NIR-Fluoreszenz der SWCNTs nicht-bleichender sowie nicht-blinkender Natur, welches wiederum längere Beobachtungsdauern von mehreren Stunden oder Tagen erlaubt. Drittens ist die NIR-Fluoreszenz von SWCNTs abhängig von ihrer chemischen Umgebung. Dies führt in Zusammenhang mit der großen Oberfläche dazu, dass Kohlenstoffnanoröhren als hochsensitive optische Sensoren zum Beispiel für die Biomarkerdetektion verwendet werden können. Diese vorteilhaften Eigenschaften können jedoch nur ihre Anwendung finden, wenn es gelingt, die einzig aus Kohlenstoffatomen bestehende Oberfläche so weit chemisch zu verändern, dass sie die selektive Erkennung z.B. von Bio- markern oder das Anvisieren von z.B. zellulären Rezeptoren ermöglicht. Zu diesem Zweck stellt diese Arbeit neue Strategien vor, mit denen kohlenstoffnanoröhrenbasierte Biosensoren generiert werden können. In einem ersten Schritt wurden Sen- soren für den Neurotransmitter Dopamin hinsichtlich ihrer Sensitivität und Selektivität charakterisiert und optimiert. Ein Screening von unterschiedlichen DNA-Sequenzen, welche auf der Nanoröhrenoberfläche adsorbieren, führte zu unterschiedlichen Kd-Werten (2.3 nM - 9.4 μM) sowie zu speziellen DNA-Sequenzen, welche es erlauben, Dopamin in Gegenwart des strukturell ähnlichen Neurotransmitters Noradrenalin zu detektieren. In einem nächsten Schritt wurde nun dieser Dopaminsensor mit kleinen Antikörperfragmenten (Nanobodies) dekoriert, welche es vermögen, ihr Antigen mit hoher Spezifität zu binden. Diese neuen zielgerichteten Sensoren wurden nicht nur umfassend in vitro charakterisiert, sondern auch in vivo in Drosophilaembryonen angewandt, um dort den Spindelapparat mittels NIR-Immunfluoreszenzmikroskopie in tiefen Gewebeschichten untersuchen zu können. Ferner erlaubte es diese neue Technik, zum ersten Mal ein sich bewegendes Kinesin-Motorprotein in einem lebenden Organismus zu verfolgen und somit ein vertieftes Verständnis wichtiger intrazellulärer Prozesse zu erlangen (wie z.B. die Geschwindigkeit, mit der sich ein Motorprotein in vivo bewegt, v = 610 ± 330 nm s-1). Darüber hinaus wurden neben DNA-Oligonukleotiden auch Peptidfässer als neuartige Oberflächenmodifikation von SWCNTs eingeführt. Diese de novo erstellten Peptidfässer bieten nicht nur eine höhere Sequenzvariabilität im Vergleich zu Nukleinsäuren, sondern ebenfalls die Möglichkeit, bestimmte SWCNT-Chiralitäten anzureichern. Außerdem haben sie das Potenzial zur Anwendung als Funktionalisierungsplattform mit der Möglichkeit, funktionale Einheiten wie Fluorophore, Medikamente oder Antikörper anzubringen. Zu guter Letzt wurden zwei neue so genannte Quantendefekte in SWCNTs eingebaut, welche zusätzlich eine Ankereinheit tragen, die nachfolgende kovalente Funktionalisierung ermöglicht. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen der kovalenten SWCNT-Funktionalisierung führen Quantendefekte zu einer Rotverschiebung, nicht jedoch zu einer Löschung der NIR-Fluoreszenz. Durch Kombination dieser photophysikalischen Vorzüge mit den Ankereinheiten war es möglich, kovalente, funktionale und NIR-fluoreszente SWCNT-Nanobody-Konjugate, mehrfarbige SWCNTs sowie SWCNT-Peptid-Hybride herzustellen. Mit der erhöhten Stabilität durch die kovalente Verknüpfung können diese Ankerquantendefekte nun als eine Plattformtechnologie dienen, um neue NIR-fluoreszente Werkzeuge für Biosensoren oder die Immunfluoreszenzmikroskopie herzustellen. Zusammengefasst stellen diese vier Technologien (DNA-basierte Dopaminsensoren, zielgerichtete Sensoren mit Nanobodies, die Peptidfass-Ummantelung sowie die Quantendefekt-Funktionalisierung) wertvolle neue Bausteine für die Herstellung von SWCNT-basierten optischen Sensoren, NIR-Werkzeugen für die Fluoreszenzmikroskopie oder Vehikeln für den zielgerichteten Transport von Medikamenten unter kontinuierlicher NIR-Observation dar. In Zukunft könnten somit neue Optionen für die Erkennung und Behandlung von Krankheiten generiert werden.
 
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