Interplay of Verticillium signaling genes favoring beneficial or detrimental outcomes in interactions with plant hosts

by Jessica Starke
Doctoral thesis
Date of Examination:2019-07-22
Date of issue:2020-07-14
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Kai Heimel
Referee:Prof. Ph.D. James Kronstad
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8101

 

 

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Abstract

English

Verticillia and their plant hosts both contribute to pathogenesis as a consequence of their interaction. Evolution-driven genome extension includes hybridization, resulting in amphidiploid species as the rapeseed pathogen Verticillium longisporum and the acquirement of Lineage Specific (LS) regions in haploid Verticillia. Whether a fungus-plant interaction results in pathogenicity or reduced susceptibility of the host depends on mutual exchange of secreted signals, their perception and intracellular transduction pathways. The genome of the haploid tomato pathogen V. dahliae JR2 includes an LS region with several genes for putative transcription factors, which is not required for virulence. Hybrid pathogenic V. longisporum isolates Vl43 or Vl145c contain the homologous Vl43LS20kb region, which is absent in the non-symptomatic hybrid Vl32. Deletion of this region in V. longisporum Vl43 led to a hypervirulent phenotype in rapeseed, suggesting a function in reducing virulence as well as susceptibility of the host plant. The Fus3/Kss1-like V. dahliae MAP kinase Vmk1 plays an essential role in regulating virulence in plants. Intracellular transduction pathways can be insulated by scaffold proteins for maintenance of specificity. The V. dahliae MAPK scaffold protein Ham5, homologous to Neurospora crassa HAM-5, has not yet been analyzed in plant pathogens. Deletion of V. dahliae HAM5 allowed wild type-like development, whereas deletion of the upstream MAP2K MEK2 reduced vegetative growth and microsclerotia formation as deletion of VMK1. MEK2 and VMK1 deletion strains were re-isolated from plant tissue, supporting their potential to invade tomato plants. Both displayed defects in induction of disease symptoms. HAM5 deletion strains induced wild type-like disease symptoms in planta. Therefore, the Vmk1/Mek2 MAPK signaling pathway-mediated regulation of vegetative growth, microsclerotia formation and pathogenicity is independent from the scaffold protein Ham5 and does not require its insulation function in V. dahliae. Plant invasion and immune suppression require secretion of correctly folded proteins monitored by the Hac1-controlled unfolded protein response (UPR) pathway. The bZIP transcription factor Hac1 is essential for virulence of the necrotrophic appressoria-forming ascomycete Alternaria brassicicola or of the basidiomycete Ustilago maydis. V. dahliae HAC1 mRNA appears in two splice variants HAC1u (uninduced) and HAC1i (induced), where only HAC1i was translated into a protein. HAC1 deletion caused significantly decreased vegetative growth, conidiation and impaired microsclerotia formation. ΔHAC1 could penetrate and initiate colonization of the root cortex of Arabidopsis thaliana, but induced only minor disease symptoms in tomato plants. Different to the MAPK deletion strains, ΔHAC1 could not be re-isolated from plant stems, corroborating deficiency in propagation within the plant. Constitutively active UPR led to increased microsclerotia formation and induced strong disease symptoms in planta. In conclusion, V. dahliae HAC1 is an important regulator of growth and differentiation with strong impact on virulence and susceptibility. Virulence is connected to fungal hormones. Fungal oxylipins control differentiation processes, secondary metabolite production or manipulation of plant host defense responses. The Ode1 oleate ∆12-fatty acid desaturase is localized to intracellular membranes and catalyzes the oxidation of oleic acid to linoleic acid as major oxylipin precursor. V. dahliae ODE1 deletion resulted in decreased vegetative growth and microsclerotia formation. However, the defect in ODE1 had minor impact on fungal virulence. In summary, the outcome of a fungus-plant interaction as result of a complex interplay of virulence enhancing and reducing mechanisms was analyzed: Lineage Specific insertions can be beneficial for the plant, single enzymes for linoleic acid production as precursor of oxylipins can make a minor contribution, whereas Hac1-regulated UPR or the scaffoldindependent pheromone response MAPK pathway are crucial for pathogenicity.
Keywords: Verticillium longisporum, Verticillium dahliae, plant pathogen, unfolded protein response, lineage specific region, MAPK signaling, Ham5 scaffold, oleate ∆12-fatty acid desaturase, microsclerotia, resting structures, virulence

German

Sowohl Verticillien als auch ihre Wirtspflanzen tragen zur Entwicklung von Krankheitssymptomen als Folge ihrer Interaktion bei. In haploiden Verticillien wurden Hybridisierungen zur Entstehung des amphidiploiden Rapspathogens Verticillium longisporum, und der Erwerb von artspezifischen Regionen (LS Regionen) als Mechanismen evolutions-getriebener Genomerweiterung beschrieben. Ob aus einer PilzPflanzeninteraktion Pathogenität oder eine reduzierte Anfälligkeit der Wirtspflanze resultiert, hängt vom gegenseitigen Austausch von sekretierten Signalen und deren Wahrnehmung, sowie von intrazellulären Transduktionswegen ab. Im haploiden Genom des Tomatenpathogens V. dahliae JR2 befindet sich eine Vl43LS20kbRegion, die für mögliche Transkriptionsfaktoren kodiert und nicht für die Virulenz benötigt wird. Die Genome der pathogenen, amphidiploiden V. longisporum Isolate Vl43 und Vl145c enthalten ebenfalls diese LS Region, die jedoch nicht im Genom des asymptomatischen Hybriden Vl32 zu finden ist. Die Deletion dieser Region führte in V. longisporum Vl43 zu verstärkten Krankheitssymptomen in Rapspflanzen, woraus eine Funktion in der Reduzierung der Virulenz oder der Anfälligkeit der Wirtspflanze hervorgeht. Die Fus3/Kss1-ähnliche MAP Kinase Vmk1 spielt eine essentielle Rolle in der Regulation der Virulenz in Pflanzen in V. dahliae. Intrazelluläre Signaltransduktionswege können durch sogenannte Scaffold-Proteine isoliert werden um die Spezifität aufrecht zu erhalten. Das entsprechende Homolog zum Neurospora crassa MAP Kinase Scaffold-protein HAM-5 wurde bisher nicht in Pflanzenpathogenen beschrieben und die Rolle der vorgeschalteten Kinase Mek2 ist in Verticillien bisher nicht bekannt. Die Deletion von V. dahliae HAM5 erlaubte eine Wildtyp-ähnliche Entwicklung, wohingegen die Deletion von MEK2, sowie die Deletion von VMK1, in reduziertem vegetativen Wachstum und verringerter Mikrosklerotienbildung resultierten. MEK2 und VMK1 Deletionsstämme konnten aus Pflanzengewebe re-isoliert werden, was ihr Potenzial in die Wirtspflanze einzudringen bestätigt. Jedoch zeigten beide Stämme Defekte in der Induktion von Krankheitssymptomen in Tomatenpflanzen. HAM5 Deletionsstämme induzierten Wildtyp-ähnliche Krankheitssymptome in der Pflanze. Somit ist die Regulation von vegetativem Wachstum, Mikrosklerotienbildung und Pathogenität, die durch den Vmk1/Mek2 MAPK-Signalweg vermittelt wird, in V. dahliae unabhängig von dem Scaffold-Protein Ham5 und erfordert dessen Isolationsfunktion nicht. Das Eindringen in die Wirtspflanze und die Immunsuppression erfordert die Sekretion von korrekt gefalteten Proteinen, welche durch den Hac1-kontrollierten Signalweg als Antwort auf ungefaltete Proteine (UPR) überwacht wird. Der bZIP Transkriptionsfaktor Hac1 ist essentiell für die Virulenz des nekrotrophen Appressorien-bildenden Ascomyceten Alternaria brassicicola, sowie des Basidiomyceten Ustilago maydis. Die V. dahliae HAC1 mRNA kommt in zwei Spleißvarianten HAC1u (uninduziert) und HAC1i (induziert) vor. Jedoch wird nur HAC1i in ein Protein übersetzt. Die Deletion von HAC1 führte zu signifikant verringertem vegetativen Wachstum, verringerter Konidienbildung und zur Unfähigkeit Mikrosklerotien als Überdauerungsstrukturen zu bilden. ΔHAC1 konnte den Wurzelkortex von Arabidopsis thaliana-Pflanzen penetrieren und die Kolonisierung initialisieren, induzierte jedoch deutlich weniger starke Krankheitssymptome in Tomatenpflanzen. Anders als die MAP Kinase-Deletionsstämme konnte ΔHAC1 nicht aus dem Pflanzenmaterial re-isoliert werden. Dies spricht für einen Defekt in der Vermehrung des Pilzes in der Pflanze. Ein konstitutiv aktiver UPR Signalweg führte zu verstärkter Mikrosklerotienbildung und einer Induktion von starken Krankheitssymptomen in Tomatenpflanzen. Folglich spielt HAC1 eine entscheidende Rolle in der Regulation von Wachstum und Differenzierung, und wird für die Virulenz von V. dahliae und die Induktion von Krankheitssymptomen in der Pflanze benötigt. Des Weiteren gibt es Verbindungen zwischen Virulenz und pilzlichen Hormonen. Diese sogenannten Oxylipine können Differenzierungsprozesse, die Produktion von Sekundärmetaboliten und die Manipulation der Immunabwehr der Wirtspflanze beeinflussen. Die Ode1 Oleat-∆12 Fettsäuredesaturase ist in intrazellulären Membranen lokalisiert und katalysiert die Oxidation von Ölsäure zu Linolsäure als Hauptvorläufer von Oxylipinen. Die Deletion des V. dahliae Gens ODE1 resultierte in verringertem vegetativem Wachstum und einer reduzierten Mikrosklerotienbildung. Allerdings zeigte der Defekt im ODE1 Gen nur einen geringen Einfluss auf die pilzliche Virulenz. Zusammenfassend wurde der Erfolg einer Pilz-Pflanzeninteraktion als Ergebnis eines komplexen Zusammenspiels aus Virulenz-verstärkenden und -reduzierenden Mechanismen untersucht: Artspezifische Insertionen im Pilzgenom können vorteilhaft für die Wirtspflanze sein, einzelne Enzyme für die Produktion von Linolsäure als Vorläufer von Oxylipinen haben einen geringen Einfluss, während der Hac1-regulierte UPR Signalweg, sowie der Scaffoldunabhängige Pheromon-MAPK-Signalweg, eine entscheidende Rolle für die Pathogenität spielen.
 
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