Preparation and investigation of an in vitro model system for the GABAA receptor organisation machinery of inhibitory post synapses

by Jonas K. Schäfer
Doctoral thesis
Date of Examination:2020-07-01
Date of issue:2020-07-22
Advisor:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Nils Brose
Referee:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8113

 

 

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Abstract

English

The synaptic communication between neuronal cells is based on the release and uptake of neurotransmitters. In the mammalian brain inhibitory signal transduction relies on the neurotransmitter γ-amino butyric acid (GABA) which is recognised by specific receptors in the post synaptic plasma membrane. These receptors experience high spatio-temporal fluctuations and thus need to be accumulated in direct opposition to the presynaptic active site to facilitate fast communication. Malfunctions in this process are origin of multiple neuronal diseases. A protein machinery composed of the cell adhesion protein neuroligin 2 (NL2), the scaffolding protein gephyrin and the adaptor protein collybistin 2 (CB2), that interacts with phosphoinositides (PtdInsPs) in the plasma membrane, is assumed to be responsible for the receptor organisation in the postsynaptic specialisations. The complex has been examined only in vivo so far, yet to characterise each constituent in detail and to investigate their intermolecular interactions an in vitro system is required. Therefore, this work focusses on the preparation of a model system, based on membranes supported by SiO2 substrates. In solid-supported lipid bilayers (SLBs) a heterogeneous distribution of the bisphosphorylated phosphoinositide (PtdIns[4,5]P2) was detected, thus solid-supported hybrid membranes (SHMs) prepared by spreading of small unilamellar vesicles (SUVs) on hydrophobically functionalised SiO2 were deployed to guarantee homogeneous distribution and comparability of all PtdInsPs (PtdIns[3]P, PtdIns[4,5]P2 and PtdIns[3,4,5]P3) tested. The adsorption of recombinantly expressed CB2 to SHMs containing the different PtdInsPs was examined by means of reflectometric interference spectroscopy (RIfS) and atomic force microscopy (AFM). In this way the isolated PH domain (CB2PH) and the point-mutated, active full-length isoform (CB2SH3/W24A-E262A) were characterised as unspecific, moderate PtdInsP interation partners, while the wild-type of CB2 (CB2SH3) was incapable of binding. Furthermore, it was shown that the height of the adsorbed protein is dictated by the C-terminal PH domain. The addition of a second receptor lipid (DGS), specific for a NL2 protein construct mimicking its intracellular domain (His-cytNL2) introduced a positive charge but did not affect the established membrane system. After fixation of His-cytNL2 to SHMs doped with DGS and PtdInsP also adsorption of CB2SH3 was detected. Thereby, the activation of the wild-type by interaction with the intracellular domain of NL2 was proven. Additionally, the activated wild-type exhibited a higher specificity compared to that of CB2SH3/W24A-E262A.
Keywords: GABAA receptor organisation; Collybistin Activation; Phosphoinositide distribution; Supported model membrane systems

German

Die Inhibition der Reizweiterleitung im Gehirn von Säugetieren beruht auf der Ausschüttung und Aufnahme von γ-Aminobuttersäure (GABA). Die Detektion dieses Neurotransmitters erfolgt durch spezifische Rezeptoren, die in der postsynaptischen Plasmamembran lokalisiert sind. Für eine schnelle und effiziente Inhibition ist die Akkumulation dieser Rezeptoren gegenüberliegend zur aktiven Zone der Präsynapse notwendig. Es wird angenommen, dass dieser Organisationsprozess auf den Proteinen Neuroligin 2 (NL2), Gephyrin und Collybistin 2 (CB2) beruht. Letzteres fungiert als Adapterprotein zwischen dem Proteinkomplex und Phosphatidylinositolphosphaten (PtdInsPs) in der Membrane. Zur genauen Characterisierung der einzelnen Bestandteile dieses Komplexes und ihrer Wechselwirkungen wurde im Rahmen dieser Arbeit ein in vitro Modell entwickelt. Dieses basiert auf festkörperunterstützten Lipidmonoschichten (SHMs), die durch das Spreiten von kleinen unilamellaren Vesikeln auf hydrophob funktionalisierten SiO2 Oberflächen erzeugt wurden. Es konnte im Vergleich mit festkörperunterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) gezeigt werden, dass es in letzteren zu einer heterogenen Verteilung von PtdIns[4,5]P2 kommt. Diese äußerte sich in einer Verarmung an zugänglichen Rezeptorlipiden, die unter der Verwendung von Markerproteinen mittels reflektometrischer Interferenzspektroskopie (RIfS) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) detektiert wurde. Auf Grund der ermittelten Vorteile wurden nochfolgend Adsorptionsstudien von CB2 auf SHMs durchgeführt, welche mit verschiedenen PtdInsPs dotiert waren. Dadurch konnte gezeigt werden, dass es sich bei allen CB2 Isoformen um unspezifische PtdInsP-Interaktionspartner handelt. Lediglich der CB2 Wildtyp zeigte keine Bindungsaktivität. Desweiteren wurde die C-terminale PH Domäne als höhenbestimmendes Proteinmodul identifiziert. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass neben der Proteinhöhe auch die Größe der adsorbierten Proteinstrukturen unabhängig vom vorliegenden PtdInsP ist. Die Erweiterung des Modellsystems um NL2 in Form der C-terminalen intrazellulären Domäne, erforderte die Dotierung mit DGS als spezifisches Rezeptorlipid zusätzlich zu PtdInsP. Für SHMs, die beide Rezeptorlipide enthielten, wurden lediglich ein um die Hälfte reduzierte Diffussionskoeffizienten detektiert. Anhand von Co-Adsorptionsstudien von CB2 nach vorheriger NL2-Injektion, konnte gezeigt werden, dass der Wildtyp durch NL2 aktiviert wird und somit in der Lage ist mit PtdInsPs zu interagieren. Somit konnte anhand des entwickelten System ein Nachweis für die Aktivierung von CB2 durch NL2 erbracht werden.
 
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