Aspergillus fumigatus F-box protein Fbx15 functions are dependent on its nuclear localisation signals and are partially conserved between A. fumigatus and A. nidulans

by Anja Abelmann
Doctoral thesis
Date of Examination:2020-03-16
Date of issue:2020-09-08
Advisor:Prof. Dr. Gerhard H. Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard H. Braus
Referee:Prof. Dr. Kai Heimel
Referee:Prof. Dr. Ralph Kehlenbach
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8189

 

 

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Abstract

English

Aspergillus fumigatus is a globally distributed opportunistic filamentous fungal pathogen mainly found in compost and represents the main cause of pulmonary aspergillosis in immunocompromised individuals. Fungal development and virulence require a highly controlled balance of regulatory protein biosynthesis, posttranslational modification and degradation for signal transduction and DNA maintenance to colonise various habitats and hosts. F-box proteins are part of the Skp1/A-Cullin -F-Box (SCF) ubiquitin RING ligase complex acting as substrate receptors for target proteins, which become posttranslational ubiquitinated for 26S proteasome mediated degradation. The Aspergillus-specific F-Box protein Fbx15 was initially described in Aspergillus nidulans as developmentally relevant protein. A. fumigatus Fbx15 is needed for the regulation of secondary metabolism such as the control of gliotoxin synthesis, as well as stress response and pathogenicity. A. fumigatus Fbx15 is unusual because a function in protein ubiquitination through SCFFbx15 complex was not yet identified, but it is required for the nuclear localisation of the essential co-repressor subunit SsnF. A. fumigatus Fbx15 carries two predicted nuclear localisation signals (NLS) within its primary amino acid sequence. This study had three issues: (i) The functions of Fbx15 and putative interaction partners were compared between A. fumigatus and A. nidulans. (ii) It was analysed whether Fbx15-mediated stress response and virulence of A. fumigatus depends on its control of the synthesis of gliotoxin or other mycotoxins. (iii) The molecular function of the two NLS of A. fumigatus Fbx15 and their impact on SsnF localisation was explored. (i) This study revealed a partial overlap in the functions of the two Aspergillus Fbx15 counterparts. Both heterologous expressed Fbx15 proteins complemented each other’s functions in secondary metabolite control and in Fbx15-mediated A. nidulans asexual and sexual development regulation. In contrast, A. nidulans Fbx15 is only partially required for stress response contrary to the crucial role in stress response of A. fumigatus Fbx15. Analysis of the interplay of Fbx15 with the transcription factors OefC and SrbB, the putative transcription factor FiAt, and the putative part of a F-type ATPase, FidA, did not elucidate a clear link to Fbx15 functions in development, stress response and/or pathogenicity. (ii) A. fumigatus Fbx15 is not only required for the regulation gliotoxin, but also for the biosynthesis of the mycotoxin fumagillin at vegetative growth. A. fumigatus Fbx15-dependent regulation of gliotoxin biosynthesis is dispensable for Fbx15-mediated stress response at minimal growth and pathogenicity in the Galleria mellonella model. (iii) Either A. fumigatus Fbx15 NLS1 or NLS2 are sufficient to support nuclear import of Fbx15 during vegetative growth under non-stress conditions. NLS1 is insensitive against stress when NLS2 is absent. NLS2 is required to exclude Fbx15 from the nuclear matrix to the nuclear periphery during oxidative stress. NLS2 is also sufficient to locate SsnF to the nuclear matrix in the absence of stress, and to the nuclear periphery with stress, whereas the sole presence of NLS1 results in constitutive nuclear SsnF. Therefore, NLS2 is the stress-responding element to control and shift the distribution of Fbx15 and of SsnF from the nuclear matrix to the periphery presumably to release the fungal cell from SsnF dependent gene repression. Fbx15 phosphorylation represents an additional layer of location control, which is not relevant during non-stress conditions. Fbx15 phosphorylation or dephosphorylation do not require intact NLS1- or NLS2 sequences. Fbx15 cellular location during oxidative stress depends on the phosphorylation or dephosphorylation status at residue S468|9. The major finding of this thesis is the identification of A. fumigatus NLS2 as control element to exclude Fbx15 and simultaneously the corepressor SsnF from the nuclear matrix during oxidative stress resulting in derepression of genes e.g. for mycotoxin formation.
Keywords: F-box; Fbx15; Aspergillus fumigatus; Aspergillus nidulans; nuclear localisation signal; NLS; development; oxidative stress response

German

Aspergillus fumigatus ist ein weltweit verbreiteter, filamentöser Pilz, der hautsächlich auf kompostierbarem Medium vorkommt. Als opportunistischer Krankheitserreger repräsentiert A. fumigatus die Hauptursache für atemwegsinvasive Aspergillose in immungeschwächten Individuen. Pilzspezifische Entwicklungsprozesse und Virulenz bedürfen eines kontrollierten Gleichgewichts der Synthese, des Abbaus sowie der posttranslationalen Modifikation regulatorischer Proteine. Solche regulatorischen Proteine werden für Entwicklungsprozesse, Signaltransduktionen und die DNA-Instandhaltung während der Kolonisierung verschiedenster Habitate oder Wirten benötigt. F-box Proteine sind Teil des Skp1/A-F-box-Cullin (SCF) Ubiquitin RING Ligasekomplexes. Sie fungieren als Substratrezeptoren für Proteine, die für ihren Abbau am 26S Proteasom posttranslational ubiquitiniert werden. Das Aspergillus-spezifische F-box Protein Fbx15 wurde erstmals in A. nidulans als entwicklungsrelevantes Protein beschrieben. A. fumigatus Fbx15 ist entscheidend für die Regulation des Sekundärmetabolismus, wobei die Biosynthese des Mykotoxins Gliotoxin reguliert wird. Zudem wird A. fumigatus Fbx15 für die Stresstoleranz und Pathogenität des Pilzes benötigt. A. fumigatus Fbx15 ist für seinen Proteintyp untypisch, da bis jetzt keine Funktion bezüglich der Proteindegradation mittels Ubiquitinierung durch den SCFFbx15 -Komplex identifiziert wurde. Stattdessen wurde eine Fbx15-abhängige Kernlokalisierung der essentiellen Ko-Repressoruntereinheit SsnF festgestellt. A. fumigatus Fbx15 besitzt zwei potentielle nukleare Lokalisierungssignale (NLS) in seiner primären Aminosäuresequenz. Diese Arbeit hatte drei Themen: (i) Die Funktionen von Fbx15 und potentieller Interaktionspartner wurden in A. nidulans und A. fumigatus miteinander verglichen. (ii) Es wurde untersucht, ob die in Abhängigkeit von A. fumigatus Fbx15 entstehende Stressantwort und Virulenz im Zusammenhang mit seiner regulatorischen Wirkung auf die Gliotoxinbiosynthese oder andere Mykotoxine steht. (iii) Die molekulare Funktion der beiden NLSs von A. fumigatus Fbx15 wurde untersucht, sowie dessen Einfluss auf die Lokalisierung von SsnF. (i) Diese Arbeit hat gezeigt, dass es eine partielle Übereinstimmung in den Funktionen der beiden Aspergillus Fbx15-Proteine gibt. Beide heterolog exprimierte Fbx15-Proteine komplementieren gegenseitig ihre jeweiligen Funktionen hinsichtlich des Sekundärmetabolismus, sowie der Fbx15-abhängigen asexuellen und sexuellen Entwicklung in A. nidulans. Im Gegensatz dazu ist A. nidulans Fbx15 nur partiell für Stresstoleranz relevant, wohingegen A. fumigatus Fbx15 eine Hauptfunktion in Stresstoleranz vorweist. Die Untersuchung der möglichen Wechselwirkung von Fbx15 mit den Transkriptionsfaktoren OefC und SrbB, des potentiellen Transkriptionsfaktors FiAt, und FidA, der potentielle Teil einer F-ATPase, wies keinen eindeutigen Zusammenhang zu Fbx15 in Entwicklung, Stressantwort und/oder Pathogenität auf. (ii) A. fumigatus Fbx15 ist nicht nur für die Regulierung von Gliotoxin verantwortlich. Es wird ebenfalls für die Regulation der Biosynthese des Mykotoxins Fumagillin während des vegetativen Wachstums benötigt. Darüber hinaus sind die regulatorischen Eigenschaften von A. fumigatus Fbx15 in Bezug auf Gliotoxin nicht für die von Fbx15 geleitete Stressantwort während des Minimalwachstums und der Pathogenität im Galleria mellonella-Model von Bedeutung. (iii) Beide NLS-Sequenzen von A. fumigatus Fbx15 werden unabhängig voneinander für den Kerntransport von Fbx15 während des vegetativen Wachstums benötigt. Dabei ist NLS1 ist für sich alleine unempfindlich gegenüber Stress. NLS2 wird hingegen für den Transport von Fbx15 von der Kernmatrix zur Kernperipherie bei oxidativem Stress benötigt. Außerdem wird NLS2 für die erfolgreiche Lokalisierung von SsnF in der Kernmatrix in Abwesenheit von Stress benötigt, sowie den Transport von SsnF zur Kernperipherie bei Stress. In diesem Prozess führt Präsenz von NLS1 ohne NLS2 zu einer kontinuierlichen Kernlokalisierung von SsnF. NLS2 ist hierbei ein Element für die Stressantwort, das für den Shift von Fbx15 und SsnF von der Kernmatrix zur Kernperipherie verantwortlich ist, um vermutlich die von SsnF verursachte Repression der Genregulation in der Zelle zu unterbinden. Die Phosphorylierung von Fbx15 repräsentiert dabei eine zusätzliche Lokalisierungskontrolle, die jedoch nicht bei vegetativen Wachstum entscheidend ist. Dephosphorylierung oder Phosphorylierung von Fbx15 benötigt keine intakte NLS1- oder NLS2-Sequenz. Dennoch ist die zelluläre Lokalisierung von Fbx15 bei oxidativem Stress abhängig von der Phosphorylierung oder Dephosphorylierung an den Aminosäuren S468|9. Das Hauptergebnis dieser Dissertation besteht in der Identifizierung von A. fumigatus Fbx15 NLS2 als Kontrollelement, um Fbx15 und SsnF simultan aus der Kernmatrix während oxidativen Stresses zu transportieren, was zu einer Derepression von Genen führt, die z.B. für die Produktion von Mykotoxinen zuständig sind.
 
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