Developmental regulators and secreted effector molecules of the fungal pathogen Verticillium spp.

by Miriam Leonard
Doctoral thesis
Date of Examination:2019-09-30
Date of issue:2020-09-29
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Kai Heimel
Referee:Prof. Dr. James Kronstad
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8222

 

 

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Abstract

English

The haploid Verticillium dahliae and the allodiploid V. longisporum are two filamentous fungal pathogens, which colonize the plant vascular system of a broad host range including important crops. They survive outside of the plant for years in the soil with microsclerotia as resting structures and colonize specific host plants through the roots. In the xylem they form conidia to facilitate transportation within the plant. This life cycle requires a tight control of fungal development and a cautious communication with the host through the secretome without causing extensive plant defense reactions. The focus of this work was (i) to explore the regulatory function of two transcriptional regulators in development, Frq (Frequency) and Sfl1 (Suppressor of flocculation 1), and (ii) to compare fungal secretomes in different environmental conditions. One major result was that Frq and Sfl1 are required for microsclerotia and conidia formation of V. dahliae. The circadian clock component Frq acts as light-dependent microsclerotia formation repressor and has the opposite function for conidia where it operates as activator. Sfl1 functions as well as activator of conidia, but also as activator of microsclerotia formation in V. dahliae. A genetic analysis using deletion mutant strains revealed that SFL1 is epistatic to FRQ because the absence of SFL1 leads to the same severe reduction of microsclerotia formation in single as in double deletion mutant strains. This suggests that SFL1 is genetically located downstream in the regulation of fungal development. This genetic analysis demonstrated as second major result that both genes are required for full virulence of V. dahliae on tomato. The fungal communication with the host plant was examined by the secretome of allodiploid V. longisporum as pathogen of rape seed. Minimal or complete media delivered a similar broad exoprotein pattern. In contrast, cultivation in the plant-related media, a pectin-rich medium or pure xylem sap isolated from Brassica napus, triggered the secretion of another exoproteome pattern that includes similar but also distinct features. This corroborates significant differences in the sensing of the fungus of different environments resulting in different secretion responses. The xylem sap-specific exoproteome included carbohydrate-active enzymes (CAZys), peptidases and proteins with effector domains. Deletion strains of the corresponding homologs of haploid V. dahliae were phenotypically similar to wildtype growth ex planta. Whereas single deletions of CAZy encoding genes, and even a double deletion of the MEP1 and MEP2 genes encoding metallopeptidases or the CP1 and CP2 encoding cerato-platanin proteins did not alter virulence, the single metalloprotease Mep1 and the necrosis and ethylene inducing-like proteins Nlp2 and Nlp3 are necessary for V. dahliae pathogenicity on tomato. Therefore, the exoproteome approach pinpointed Mep1, Nlp2 and Nlp3 as single effectors required for successful V. dahliae colonization whereas other secreted proteins might provide redundant functions. This study shows the flexibility of the Verticillium response throughout the life cycle to adjust to distinct external stimuli. Developmental regulators such as the Frq and Sfl1 proteins are essential for microsclerotia or conidia production and for pathogenicity. The secretome response adapts with a distinct pattern to different nutrient combinations in the environment. En masse, these findings revealed Frq, Sfl1, Mep1 and Nlp2/3 as factors important for V. dahliae virulence, which all display potential targets for new growth control strategies of the fungus.
Keywords: Verticillium longisporum; Verticillium dahliae; plant pathogen; plant- and media-dependent exoproteomes; effectors; developmental regulators

German

Der haploide Pilz Verticillium dahliae und sein allodiploider Verwandter V. longisporum gehören zu den filamentösen Pflanzenpathogenen. Sie kolonisieren das vaskuläre System eines breiten Wirtsspektrums einschließlich wichtiger Nutzpflanzen. Durch die Ausbildung von Mikrosklerotien als Überdauerungsstrukturen überleben diese Pilze außerhalb der Pflanze über Jahre im Boden und kolonisieren spezifische Wirtspflanzen über die Wurzeln. Dieser Lebenszyklus ist abhängig von einer strengen Kontrolle der pilzlichen Entwicklung und einer umsichtigen Kommunikation mit dem Wirt über das Sekretom um das Auslösen umfassender Pflanzenabwehrreaktionen zu vermeiden. Der Fokus dieser Arbeit lag (i) auf der Untersuchung der regulatorischen Funktionen zweier transkriptioneller Regulatoren in der Entwicklung, Frq (Frequency) und Sfl1 (Suppressor of flocculation 1), und (ii) auf dem Vergleich pilzlicher Sekretome unter unterschiedlichen Umweltbedingungen. Ein bedeutendes Ergebnis war, dass Frq und Sfl1 für die Mikrosklerotien- und Sporenbildung von V. dahliae benötigt werden. Als Komponente der zirkadianen Uhr agiert Frq als Licht-abhängiger Repressor der Mikrosklerotienbildung und hat als Aktivator eine entgegengesetzte Funktion auf die Konidienbildung. Sfl1 zeigt ebenfalls eine Aktivatorfunktion auf die Konidienbildung, aber auch auf die Ausbildung von Mikrosklerotien in V. dahliae. Eine genetische Analyse unter der Nutzung von Deletionsstämmen zeigte, dass SFL1 epistatisch zu FRQ ist, da die Abwesenheit von SFL1 in Einzel- und Doppeldeletionen zu einer ähnlich starken Reduktion der Mikrosklerotienbildung führte. Die genetische Analyse demonstrierte als zweites bedeutendes Ergebnis, dass beide Gene für die vollständige Virulenz von V. dahliae in Tomatenpflanzen benötigt werden. Die pilzliche Kommunikation mit der Wirtspflanze wurde anhand des Sekretoms des allodiploiden Rapspathogens V. longisporum untersucht. Minimal- oder Vollmedium lieferten ein ähnlich breites Exoproteinmuster. Im Gegensatz führte die Kultivierung in den Pflanzen-ähnlichen Umgebungen, einem Pektin-reichen Medium oder purem Xylemsaft, welcher aus Brassica napus isoliert wurde, zur Sekretion eines weiteren Exoproteinmusters, welches sowohl gemeinsame als auch spezifische Eigenschaften aufwies. Dies bekräftigt, dass signifikante Unterschiede in der Wahrnehmung von unterschiedlichen Umgebungen in spezifischen Sekretionsantworten resultieren. Das Xylemsaft-spezifische Exoproteom enthält „carbohydrate-active enzymes“ (CAZys), Peptidasen und Proteine mit Effektordomänen. Deletionsstämme der entsprechenden Homologe des haploiden V. dahliae waren außerhalb der Pflanze phänotypisch ähnlich zum Wildtyp. Einzeldeletionen der CAZy-kodierenden Gene, eine Doppeldeletion der Metalloproteasen-kodierenden MEP1 und MEP2 Gene oder der Ceratoplataninprotein-kodierenden CP1 und CP2 Gene veränderten die Virulenz nicht. Im Gegensatz dazu werden „necrosis and ethylene inducing-like“ Proteine Nlp2 and Nlp3 und die einzelne Metalloprotease Mep1 für die Pathogenität von V. dahliae in Tomaten benötigt. Die Analyse des Exoproteoms hat Mep1, Nlp2 und Nlp3 als einzelne Effektoren identifiziert, welche für die erfolgreiche Kolonisierung durch V. dahliae benötigt werden. Andere sekretierte Proteine hingegen haben möglicherweise redundante Funktionen. Diese Untersuchung zeigt die Flexibilität der Antwort, mit welcher Verticillium sich während seines Lebenszyklus an bestimmte externe Stimuli anpasst. Regulatoren der Entwicklung wie die Proteine Frq und Sfl1 sind sowohl essentiell für die Mikrosklerotien- und Konidienbildung als auch für die Pathogenität. Die Sekretomantwort passt sich mit bestimmten Mustern an unterschiedliche Nährstoffbedingungen in der Umwelt an. Zusammenfassend wurden Frq, Sfl1, Mep1 und Nlp2/3 als wichtige Faktoren der Virulenz von V. dahliae identifiziert, welche potentielle Angriffspunkte für die Entwicklung von neuen Strategien zur Wachstumskontrolle des Pilzes bieten.
 
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